鹅干扰素-α在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究

论文摘要

干扰素（interferons, IFNs）是一种可诱导细胞因子的多基因家族,其主要作用是抵抗病毒感染的免疫防御以及抗增殖和免疫调节作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。为了更好的探讨基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂的可能性,本研究将去除信号肽的鹅α干扰素基因置于毕赤酵母α因子分泌信号肽后,构建能分泌表达goIFN-α蛋白的重组表达质粒pPICZaA-goIFN-α,将其转化到毕赤酵母宿主菌X33中,实现了其在毕赤酵母中的高效表达。并采用微量细胞病变抑制法分析研究了goIFN-α生物活性,为进一步的研究与开发鹅干扰素类制剂打下基础。其主要结果如下：1、根据NCBI上本课题组已提交的天府肉鹅基因序列（序列号为HQ115583）,设计并合成一对引物,应用PCR技术从含有天府肉鹅IFN-α完整基因的重组质粒pMD18-T-goIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,克隆到pMD18-T载体上。将DNA序列测定正确的克隆质粒pMDT-IFNa用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后与同样经EcoRⅠ和XbcⅠ双酶切的pPICZαA连接过夜,转化大肠杆菌感受态DH5a,得到重组表达质粒pPICZaA-goIFN-a,并对重组表达质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定以及序列测定。2.将验证正确的重组表达质粒用sacⅠ进行单酶切,采用电转化法将线性化的重组质粒电穿孔导入毕赤酵母宿主菌X33,涂布YPDS+Zeocin选择性培养基,置30。C温箱培养3-5天,结果获得多个白色的菌落。分别挑选生长良好的3株不同的白色单菌落,先用BMGY培养基激活培养,离心后用BMMY培养基重悬菌体,每隔24小时添加1%的甲醇进行诱导表达72小时后,离心收集菌液。冻干法浓缩后的菌液,经斑点杂交筛选出高拷贝的转化子。将筛选出的高拷贝菌落重新进行诱导表达,并用Elisa法确定最佳的表达时间和甲醇浓度。重组子经最佳表达方法诱导表达后,离心收集菌液,用TCA浓缩后的蛋白,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,结果表明分泌于胞外的鹅IFN-α蛋白分子量大约为22 kDa,比理论值（18.7 kDa）略大,估计是表达产物在表达过程中发生一定的糖基化所致。3.采用微量细胞病变抑制法评价了表达的重组鹅IFN-α的抗病毒活性。制备鹅胚成纤维细胞,采用TCID50法测定VSV病毒株的鹅胚成纤维细胞的半数感染量。表达的蛋白经透析、过滤除菌处理后,分析研究其生物活性,结果显示鹅IFN-α对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/ml。综上所述,本研究成功的克隆了天府肉鹅干扰素-α基因,成功构建了鹅IFN-α的真核表达质粒,实现了其在毕赤酵母中的高效表达,表达产物并具有明显的抗病毒活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1. 干扰素的概况
• 1.1 干扰素的产生和分类
• 1.2 干扰素的性质和生物学特性
• 1.2.1 干扰素的基本特性
• 1.2.2 干扰素的生物学特性
• 1.3 水禽干扰素国内外研究进展
• 1.4 兽用干扰素的临床应用
• 2 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究
• 2.1 简介
• 2.1.1 毕赤酵母表达系统的生物学特点
• 2.1.2 甲醇酵母的代谢
• 2.1.3 甲醇利用表型
• 2.2 表达系统的启动子
• 2.2.1 AOX1启动子和GAP启动子
• 2.2.2 AOX2启动子
• 2.2.3 FLD1启动子
• 2.2.4 ICL1启动子
• 2.3 控制蛋白质水解作用
• 2.3.1 培养水平策略
• 2.3.2 细胞水平策略
• 2.3.3 蛋白质水平策略
• 2.4 分泌蛋白的翻译后修饰
• 2.4.1 分泌信号作用及二硫键的形成
• 2.4.2 糖基化
• 2.5 影响外源蛋白表达的因素
• 2.5.1 外源基因的内在特性
• 2.5.2 基因拷贝数
• 2.5.3 宿主菌的甲醇利用表型
• 2.5.4 培养条件
• 2.6 展望
• 3. 研究的目的及意义
• 第二章 干扰素的克隆与真核表达载体的构建
• 1. 实验材料
• 1.1 菌株/载体/质粒
• 1.2 实验仪器及试剂
• 1.2.1 主要的仪器设备
• 1.2.2 主要试剂
• 1.3 相关溶液的配制
• 2. 实验方法
• 2.1 干扰素成熟蛋白基因的PCR扩增、克隆和鉴定
• 2.1.1 引物的设计与合成
• 2.1.2 鹅干扰素α基因的PCR扩增
• 2.1.3 扩增产物的回收与纯化
• 2.1.4 PCR纯化产物与克隆载体的连接
• 2.1.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 2.1.6 转化感受态
• 2.1.7 重组质粒的PCR和酶切鉴定
• 2.2 重组真核表达质粒的构建
• 2.2.1 pMDT-IFNα与表达载体pPICZαA的提取、酶切与回收
• 2.2.2 pMDT-IFNα与表达载体pPICZαA的连接
• 2.2.3 连接产物的转化
• 2.2.4 转化菌落的PCR及酶切鉴定
• 3. 结果
• 3.1 天府肉鹅干扰素基因的克隆与鉴定
• 3.1.1 鹅IFN-α的PCR鉴定
• 3.1.2 重组质粒pMDT-IFNα双酶切鉴定
• 3.2 真核表达载体的构建及鉴定
• 4. 讨论
• 4.1 引物的设计
• 4.2 表达载体的选择
• 第三章 鹅干扰素在毕赤酵母中的表达及抗病毒活性
• 1. 实验材料
• 1.1 菌株/质粒/病毒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 相关溶液的配制
• 2. 实验方法
• 2.1 携带目的基因的重组酵母的构建
• 2.1.1 真核表达质粒pPICZαA-IFNα的线性化
• 2.1.2 线性化质粒的纯化
• 2.1.3 感受态X-33的制备
• 2.1.4 毕赤酵母的电击转化
• 2.1.5 重组酵母基因组PCR鉴定
• 2.2 酵母转化子的诱导表达
• 2.2.1 Mut型重组酵母的初步诱导表达
• 2.2.2 斑点法筛选高表达菌株
• 2.2.3 表达条件的优化
• 2.2.4 双抗体夹心ELISA检测表达条件的优化
• 2.3 酵母表达天府肉鹅干扰素蛋白的鉴定
• 2.3.1 SDS-PAGE样品的制备
• 2.3.2 SDS-PAG和Western-blot电泳检测表达情况
• 2.4 重组鹅干扰素抗病毒活性检测
• 2.4.1 鹅胚成纤维细胞（GEF）的制备
• 2.4.2 水泡性口炎病毒（VSV）的扩增与保存
• 2.4.3 VSV的滴定
• 2.4.4 鹅干扰素的抗病毒活性检测
• 3. 实验结果
• 3.1 酵母转化子的PCR鉴定
• 3.2 DOT-BLOT法筛选高表达菌株
• 3.3 表达条件的优化
• 3.4 表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.5 表达产物的WESTERN-BLOT检测
• 3.6 VSV效价的滴定（REED-MUENCH法）
• 3.7 GEF细胞内干扰素的抗病毒生物学活性
• 4.讨论
• 4.1 转化方法的选取
• +酵母转化子的PCR筛选'>4.2 MUT⁺酵母转化子的PCR筛选
• 4.3 干扰素在毕赤酵母中的表达
• 4.4 干扰素的抗病毒活性
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢