甘蔗内生固氮菌的分离鉴定与不同氮水平对其固氮的影响

论文摘要

为了挖掘广西的甘蔗生物固氮资源,分离筛选内生固氮菌株并探讨不同氮水平对甘蔗生物固氮的影响,本研究以Q124、Co281、B8等甘蔗品种为材料,从中分离得到21个具有乙炔还原活性的菌株。对部分菌株进行了生理生化测定、16S rRNA基因和nifH固氮基因克隆鉴定,同时研究了不同氮水平（0N、1/2 N）对甘蔗品种B8和ROC22体内固氮酶活性、植物活性物质多糖的影响。主要结果如下:1.通过对菌株进行生理生化特性、16S rRNA基因和nifH固氮基因克隆鉴定,研究表明:L2属于克雷伯氏菌属（Klebsiella）,PCR扩增表明其16S rRNA基因全序列大小为1449 bp,nifH基因大小为724 bp;L3属于肠杆菌属（Enterobacteriaceae bacterium）,PCR扩增表明其16S rRNA基因全序列大小为1448 bp,nif H基因大小为365 bp;L4属于克雷伯氏菌属（Klebsiella）,PCR扩增表明其16S rRNA基因序列大小为904 bp。2.甘蔗品种B8的多糖含量在7、8、9月较高,ROC22的多糖含量在8、9月较高,可见都是在伸长盛期较高。经过回接固氮菌后脱毒与不脱毒B8品种基本上都表现出0 N水平处理的高于1/2 N水平处理的;ROC22不脱毒+接菌处理后表现的是0 N水平处理的低于1/2 N水平处理的。3.甘蔗在1/2 N处理下表现出更高的固氮活性。甘蔗分别经不脱毒、接菌处理和不脱毒、不接菌处理后,品种B8和ROC22都表现出0 N水平处理的固氮酶活性低于1/2 N水平处理的。4.热处理脱毒对甘蔗的固氮作用有显著的影响,固氮菌回接进脱毒处理蔗株体内,较不脱毒处理的更能够发挥它的固氮作用。5.品种ROC22本身可能具有较高的生物固氮能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 自然界的生物固氮
• 1.2 固氮酶活性的测定方法研究
• 1.3 固氮基因
• 1.4 联合固氮研究
• 1.5 甘蔗内生联合固氮
• 1.5.1 甘蔗内生固氮菌种类
• 1.5.2 甘蔗内生固氮菌的回接方法研究
• 1.5.3 甘蔗内生固氮作用研究
• 1.5.4 甘蔗固氮作用与甘蔗生物能源利用新途径
• 1.6 国内外甘蔗固氮研究现状
• 1.7 本课题立论依据及意义
• 2 甘蔗内生固氮菌的分离、鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试甘蔗品种
• 2.1.1.2 实验试剂
• 2.1.1.3 试验所用培养基
• 2.1.2 甘蔗内生固氮菌的分离纯化
• 2.1.3 内生固氮菌的固氮酶活性检测
• 2.1.4 固氮菌生理生化特性测定
• 2.1.4.1 革兰氏染色
• 2.1.4.2 甲基红试验（MR）
• 2.1.4.3 接触酶试验
• 2.1.4.4 明胶水解
• 2.1.4.5 氧化酶
• 2.1.4.6 脲酶
• 2.1.4.7 硝酸还原酶
• 2.1.4.8 硫化氢
• 2.1.4.9 柠檬酸盐利用
• 2.1.4.10 吲哚试验
• 2.1.4.11 碳水化合物利用
• 2.1.5 CTAB法提取甘蔗内生联合固氮菌DNA
• 2.1.6 固氮菌的16S rRNA基因分析
• 2.1.6.1 固氮菌的16S rRNA基因扩增
• 2.1.6.2 固氮菌的16S rRNA基因扩增片段纯化
• 2.1.6.3 酶切
• 2.1.6.4 固氮菌的16S rRNA基因测序
• 2.1.7 固氮菌的固氮基因nifH克隆
• 2.1.7.1 固氮菌的固氮基因nifH扩增
• 2.1.7.2 固氮基因目标片段的回收
• 2.1.7.3 JM109感受态细胞的制备
• 2.1.7.4 固氮基因目标片段连接质粒
• 2.1.7.5 质粒DNA的提取
• 2.1.7.6 测序
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 甘蔗内生联合固氮菌的分离
• 2.2.2 部分菌株的生理生化特性
• 2.2.3 固氮菌的16S rRNA基因扩增
• 2.2.4 酶切
• 2.2.5 16S rRNA基因序列分析
• 2.2.6 固氮菌的nifH固氮基因克隆与测序分析
• 2.3 讨论
• 3 不同氮水平下甘蔗固氮对植物活性物质多糖的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 甘蔗品种与菌种
• 3.1.1.2 仪器与试剂
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 标准固氮菌株培养
• 3.1.2.2 蔗茎处理与回接试验
• 3.1.2.3 催芽试验
• 3.1.2.4 长苗试验
• 3.1.2.5 桶栽试验及采样方法
• 3.1.2.6 甘蔗多糖预备试验
• 3.1.2.7 甘蔗多糖的提取
• 3.1.2.8 甘蔗多糖的含量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不同处理下甘蔗多糖含量测定
• 3.3 讨论
• 4 不同氮水平下不同处理的甘蔗氮代谢
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 甘蔗品种与固氮菌菌种
• 4.1.1.2 仪器与试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 固氮酶活性检测
• 4.1.2.2 叶绿素含量测定
• 4.1.2.3 谷胺酰胺合成酶活性（GS）测定
• 4.1.2.4 全氮含量测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同氮水平下甘蔗各处理的固氮酶活性
• 4.2.2 不同氮水平下甘蔗各处理的叶绿素含量
• 4.2.3 不同氮水平下甘蔗各处理的谷胺酰胺合成酶（GS）活性
• 4.2.4 不同氮水平下甘蔗各处理的全氮含量
• 4.3 讨论
• 4.3.1 不同氮水平下甘蔗各处理的固氮酶活性
• 4.3.2 不同氮水平下甘蔗各处理的氮代谢差异
• 5 试验存在的问题与研究后续工作
• 5.1 试验存在的问题
• 5.2 本研究的后续工作
• 致谢
• 参考文献
• 读研期间发表的论文
• 附录A 试验所用培养基
• 附录B 固氮菌的16S rRNA基因测序结果
• 附录C 固氮菌的nifH基因测序结果