香蕉枯萎病菌两个新基因的敲除和功能初探

论文摘要

尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC）引起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害。为了给深入研究FOC与拮抗真菌,FOC与香蕉之间互作的分子机理提供理论依据,本研究从尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4, FOC4）的基因库中挑选了推测的两个相关基因FOC4B001、FOC4B003,对他们进行基因敲除,分析它们的表型变化,初步确定它们在尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中的作用。对编码的氨基酸序列进行分析,发现基因FOC4B001具有GTP结合位点、环化腺苷酸作用位点、G蛋白β-γ亚基复合体结合位点,假设的膜受体结合位点。同时氨基酸序列比对结果显示,该序列与粗糙脉胞菌（Neurospora crassa）、木霉（Trichoderma）、稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的G蛋白α亚基氨基酸序列具有较高同源性,但与已知的两个尖孢镰刀菌的G蛋白α亚基同源性较低,推测该基因为FOC4的一个新的G蛋白α亚基基因。基因FOC4B003为FOC4的特有基因,对其编码的氨基酸序列进行分析,发现该基因产物具有一段约150个氨基酸残基大小的异核体不亲和蛋白（heterokaryon incompatibility proteins, HET）的保守基序,推测该基因与异核体不亲和相关。为了解这两个基因的作用,本实验对这两个基因进行基因敲除。首先利用带有绿色荧光蛋白基因的DNA片段进行原生质体转化,得到绿色荧光蛋白标记的FOC4菌株,确定了FOC4原生质体转化体系。随后构建了2个敲除载体,并用限制性内切酶将用于转化的片段切下,通过原生质体转化,将含有同源序列的DNA片段转化至FOC4中,获得基因缺失突变体,其中FOC4B003基因缺失突变体具有绿色荧光蛋白基因。突变体表型分析发现,两个基因缺失突变体在菌丝形态上与野生型有些差异,并且都表现出耐热性的提高。而在菌落形态,孢子形态,生长速率与野生型并没有太大差异。在与其他真菌的对峙培养实验中,FOC4B003基因缺失菌株表现出对供试的木霉菌具有一定的抗性,而野生型FOC4菌株没有抗性,表明该基因在FOC4与其他真菌的互作中具有一定的作用。在致病性上,两个基因缺失突变体与野生型无明显差异。本实验通过分析FOC4两个基因核酸序列及氨基酸序列,和利用基因敲除方法初步探索两个未知基因的功能,为深入研究两基因的生物学功能奠定了基础。同时本实验还确定了香蕉枯萎病病原菌的基因敲除体系,为该病原菌基因库中其他基因的功能研究提供了技术支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 香蕉枯萎病及其病原菌
• 1.2 尖孢镰刀菌的侵染过程
• 1.2.1 附着
• 1.2.2 入侵
• 1.2.3 定殖
• 1.2.4 发病
• 1.3 信号传导在真菌致病过程中的作用
• 1.3.1 MAPK途径
• 1.3.2 G蛋白与G蛋白偶联途径
• 1.4 异核体不亲和
• 1.5 真菌的基因功能研究
• 1.5.1 基因敲除
• 1.5.2 RNA干扰
• 1.5.3 超表达
• 1.5.4 酵母双杂交技术
• 1.5.5 转座子标签技术
• 1.5.6 基因诱捕技术
• 1.6 本研究的目的及意义
• 2 材料方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌种与质粒
• 2.1.1.2 药品及试剂
• 2.1.1.3 引物合成与DNA测序
• 2.1.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 FOC4的活化与致病性验证
• 2.2.2 FOC4的潮霉素抗性实验
• 2.2.3 目的基因的PCR验证
• 2.2.3.1 FOC4,FOC1基因组DNA的提取
• 2.2.3.2 目的基因的PCR扩增
• 2.2.4 目的基因的序列分析
• 2.2.5 基因敲除中原生质体转化体系的确定
• 2.2.5.1 含有绿色荧光蛋白基因的DNA片段的获得
• 2.2.5.1.1 pCT74质粒的提取
• 2.2.5.1.2 pCT74质粒的酶切及含有绿色荧光蛋白基因的DNA片段的回收
• 2.2.5.2 绿色荧光蛋白基因的FOC4原生质体转化
• 2.2.5.2.1 原生质体的制备
• 2.2.5.2.2 原生质体的转化
• 2.2.6 敲除载体构建
• 001基因敲除载体的构建'>2.2.6.1 FOC4B₀01基因敲除载体的构建
• 2.2.6.1.1 同源臂的克隆
• 2.2.6.1.1.1 同源臂的PCR扩增
• 2.2.6.1.1.2 同源臂的PCR扩增产物的回收
• 2.2.6.1.1.3 回收产物的连接
• 2.2.6.1.1.4 连接产物的转化
• 2.2.6.1.1.5 克隆载体的筛选与鉴定
• 001A连接至载体pCX62'>2.2.6.1.2 FOC4B₀01A连接至载体pCX62
• 001A和载体pCX62线性片段的获得'>2.2.6.1.2.1 FOC4B₀01A和载体pCX62线性片段的获得
• 001A与pCX62片段的连接'>2.2.6.1.2.2 FOC4B₀01A与pCX62片段的连接
• 2.2.6.1.2.3 连接产物的转化
• 2.2.6.1.2.4 重组质粒的酶切鉴定
• 001B连接至载体FOC4B₀01A-pCX62'>2.2.6.1.3 FOC4B₀01B连接至载体FOC4B₀01A-pCX62
• 001A-pCX62大片段与FOC4B₀01B片段的获得'>2.2.6.1.3.1 FOC4B₀01A-pCX62大片段与FOC4B₀01B片段的获得
• 2.2.6.1.3.2 回收片段的连接
• 2.2.6.1.3.3 连接产物的转化
• 2.2.6.1.3.4 重组质粒的酶切鉴定
• 003基因的敲除载体构建'>2.2.6.2 FOC4B₀03基因的敲除载体构建
• 2.2.6.2.1 同源臂的克隆
• 2.2.6.2.1.1 同源臂的PCR扩增
• 2.2.6.2.1.2 PCR扩增产物的回收、连接和转化
• 2.2.6.2.1.3 克隆载体的筛选与鉴定
• 003A连接至载体pCT74'>2.2.6.2.2 FOC4B₀03A连接至载体pCT74
• 003A与载体pCT74线性片段的获得'>2.2.6.2.2.1 FOC4B₀03A与载体pCT74线性片段的获得
• 003 A与pCT74片段的连接'>2.2.6.2.2.2 FOC4B₀03 A与pCT74片段的连接
• 2.2.6.2.2.3 连接产物的转化
• 2.2.6.2.2.4 重组质粒的酶切鉴定
• 003B连接至载体FOC4B₀03A-pCT74'>2.2.6.2.3 FOC4B₀03B连接至载体FOC4B₀03A-pCT74
• 003A-pCT74大片段与FOC4B₀03B的获得'>2.2.6.2.3.1 FOC4B₀03A-pCT74大片段与FOC4B₀03B的获得
• 2.2.6.2.3.2 回收片段的连接
• 2.2.6.2.3.3 连接产物的转化
• 2.2.6.2.3.4 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.7 敲除载体的FOC4转化
• 2.2.7.1 转化片段的获得
• 2.2.7.2 原生质体的制备及转化
• 2.2.8 转化子的PCR鉴定
• 2.2.8.1 转化子的小量DNA提取
• 2.3.8.2 转化子的潮霉素基因PCR验证
• 2.3.8.3 转化子插入片段的定点插入PCR验证
• 2.3.8.4 转化子的基因PCR验证
• 2.2.9 目的基因缺失突变体的表型分析
• 2.2.9.1 目的基因缺失突变体菌落形态及其生长速率的测定
• 2.2.9.2 目的基因缺失突变体的孢子形态观察
• 2.2.9.3 目的基因缺失突变体的菌丝形态观察
• 2.2.9.4 目的基因缺失突变体的热敏感性试验
• 003基因缺失突变体的绿色荧光蛋白在显微镜下的观察'>2.2.9.5 ΔFOC4B₀03基因缺失突变体的绿色荧光蛋白在显微镜下的观察
• 003基因缺失突变体与木霉的对峙实验'>2.2.9.6 ΔFOC4B₀03基因缺失突变体与木霉的对峙实验
• 2.2.9.7 目的基因缺失突变体的致病性试验
• 3 结果与分析
• 3.1 FOC4的致病力验证与再分离
• 3.2 FOC4的潮霉素抗性实验
• 3.3 目的基因的PCR验证
• 3.4 基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分析结果
• 3.5 基因敲除中原生质体转化体系的确定
• 3.6 同源臂的克隆
• 001A-pCX62和FOC4B₀03A-pCT74的酶切鉴定'>3.7 FOC4B₀01A-pCX62和FOC4B₀03A-pCT74的酶切鉴定
• 001AB-pCX62和FOC4B₀03AB-pCT74的酶切鉴定'>3.8 FOC4B₀01AB-pCX62和FOC4B₀03AB-pCT74的酶切鉴定
• 3.9 转化片段的获得
• 3.10 转化子的PCR验证
• 3.11 目的基因缺失突变体菌落形态及其生长速率的测定
• 3.12 目的基因缺失突变体的孢子形态,菌丝形态观察
• 3.13 目的基因缺失突变体的热敏感性试验
• 003基因缺失突变体在共聚焦显微镜下的观察'>3.14 ΔFOC4B₀03基因缺失突变体在共聚焦显微镜下的观察
• 003与木霉的对峙实验'>3.15 ΔFOC4B₀03与木霉的对峙实验
• 3.16 目的基因缺失突变体的致病性及入侵观察
• 4 讨论
• 4.1 FOC4的活化与与致病性验证
• 4.2 FOC4的潮霉素抗性实验
• 4.3 目的基因的PCR验证
• 4.4 序列分析
• 4.5 基因敲除转化体系的确定
• 4.6 载体骨架的选择
• 4.7 同源臂的克隆
• 4.8 同源臂的连接
• 001-AhphB和FOC4B₀03-Ahph-gfpB片段的原生质体转化'>4.9 FOC4B₀01-AhphB和FOC4B₀03-Ahph-gfpB片段的原生质体转化
• 4.10 FOC4转化子的PCR鉴定
• 4.11 目的基因的缺失对FOC4菌落形态、生长速率、孢子形态、菌丝形态的影响
• 4.12 目的基因的缺失对FOC4抗热性的影响
• 003与木霉的相互作用'>4.13 ΔFOC4B₀03与木霉的相互作用
• 4.14 两个基因缺失突变体的致病性分析
• 6 结论
• 7 参考文献
• 附录1 本文所用的引物列表
• 致谢