论文摘要
目的收集临床IVF剩余的正常受精胚胎、异常受精胚胎和植入前遗传学诊断异常的胚胎进行囊胚培养,分离培养新的正常hESCs以及疾病模型hESCs;研究早期胚胎、干细胞的自发分化和诱导分化过程中细胞骨架和线粒体的形成和分布特征,分析细胞骨架的变化以及线粒体数量形态的变化与胚胎干细胞分化的关系。材料和方法hESCs系的建立:胚胎来源于浙江大学附属妇产科医院生殖中心,患者签署了知情同意书后,使用其没有冻存价值的正常受精的废弃胚胎以及0PN,1PN,3PN和植入前遗传学诊断为异常的废弃胚胎。选择受精后5-7天内发育到扩张囊胚（expandedblastoeyst）的胚胎,用于内细胞团（Inner cell mass,ICM）的分离。使用机械法、免疫外科、全囊胚贴壁法分离内细胞团。随后进行ICM增殖物的离散、传代和扩增,冻存hESCs,并进行鉴定。hESCs的鉴定:碱性磷酸酶活性染色、对细胞是否表达干细胞标志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4进行免疫荧光鉴定、采用RT-PCR检测hESCs中干细胞特异性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4,Rex1等7个基因的表达情况,进行hESCs核型分析以及hESCs的三胚层体外分化实验。线粒体和细胞骨架的动态观察:超排卵后收集不同发育阶段的卵母细胞和胚胎;常规hESCs培养,进行类胚体途径的ES自发分化;常规小鼠胚胎干细胞的培养和增殖与传代。参照Huang（2006）的RA诱导进行mES定向分化。常规免疫荧光技术进行线粒体（Mitotrack Red）和细胞骨架（FITC conjugated mouse anti-β-tubulin）的荧光染色。透射电镜的切片染色按照常规方法进行。结果1.从正常受精胚胎中分离了两株的hESCs分别被命名为ZJ01和ZJ02,从非正常受精胚胎分离了四株hESCs分别被命名为ZJ03、ZJ04、ZJ05以及ZJ06。所有干细胞呈典型的集落样生长,集落边缘光滑清晰,细胞排列紧密,细胞具有较高的核质比和2-3个明显的核仁;对干细胞进行鉴定,发现ZJ01,ZJ02,ZJ03,ZJ04干细胞的碱性磷酸酶活性染色强阳性,且均表达干细胞标志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4;RT-PCR检测表明,这两株干细胞表达干细胞特异性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4和Rex1;核型分析结果表明,ZJ01,ZJ02,ZJ04干细胞系为正常的二倍体,ZJ03为4号染色体三体的干细胞,可作为疾病（染色体病）模型干细胞;体外分化实验证明,上述干细胞系具有向三胚层分化能力。2.从合子到八细胞期,卵裂球内线粒体基本呈现均匀分布,没有极化现象;从桑椹胚到囊胚,卵裂球内细胞骨架结构明显,且线粒体的分布也从原来的均匀分布到极化分布;4.未分化的干细胞中,微管蛋白及微管均均匀分布,干细胞开始发生分化后,微管蛋白的表达量及微管数量显著增加,随着分化程度的深入,微管结构出现;未分化的干细胞中,线粒体亦均匀分布于细胞质中,发生分化后,线粒体出现极化分布现象,明显分布在细胞的一端;类胚体中微管结构明显,线粒体集中分布在微管周围;RA诱导后,分化细胞的类型呈现不同的微管和线粒体的分布特性。结论1.成功构建两株正常hESCs和四株异常受精的疾病模型hESCs。2.在干细胞以及早期胚胎细胞分化开始前,细胞质足够的细胞骨架蛋白以及细胞骨架结构的形成是细胞分化的必要前提;在不同胚层的分化过程中,细胞骨架分布模式具有特殊性,细胞骨架是细胞形态的决定因素,可能决定细胞分化方向,线粒体的分布模式能推断细胞分化的方向。