一、两栖动物性别决定的研究进展（论文文献综述）
唐韵[1]（2021）在《虎纹蛙表型变异的温度和芳香化酶抑制剂影响及性腺转录组学分析》文中研究说明
戴生飞[2]（2021）在《Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究》文中研究指明生殖是最基本的生命活动之一,也是物种延续的保障。生殖包括性别决定、性腺分化、配子发生、受精等一系列过程。脊椎动物的性腺主要由体细胞和生殖细胞构成,其中生殖细胞是唯一能将遗传信息传递至下一代的细胞。因此,脊椎动物性别决定可分为体细胞性别决定和生殖细胞性别决定两部分。胚胎发育过程中,性腺体细胞性别由遗传因子（性别决定基因）和环境因子（光照,温度,p H等）共同决定。传统观点认为,性腺中生殖细胞根据其所处的体细胞环境获得相应的性别。然而,青鳉（Oryzias latipes）中对foxl3的研究挑战了这一观点,缺失foxl3的XX青鳉生殖细胞在雌性体细胞环境中进行了精子发生,并产生可育的精子。由此提出生殖细胞中存在自主的性别决定机制。然而,尚未解决的重要问题是,缺失foxl3后生殖细胞中的哪些关键基因起始了雌性环境中的精子发生过程?在雌性生殖细胞中与foxl3相拮抗的雄性命运决定基因是什么?已有的研究表明,脊椎动物性腺中保守的转录因子dmrt1和foxl2相互拮抗并分别维持雌雄性别分化和性腺发育过程。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中结果表明,敲降dmrt1会导致雄性性腺体细胞雌性化和生殖细胞缺失。敲除foxl2或过表达其显复性突变体导致完全的由雌向雄的性逆转。foxl3是foxl2的一个古老的旁系同源基因,罗非鱼foxl3的功能研究尚未见报道。罗非鱼生殖细胞中相互拮抗的雌雄基因是什么?这个问题还有待进一步的研究。本研究通过转录组测序、蛋白免疫印记（Western blot,WB）、荧光原位杂交（FISH）等方法分析了dmrt1和foxl3在尼罗罗非鱼性腺的表达模式和细胞定位。运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了dmrt1和foxl3单基因突变体,并通过双杂合突变体进一步繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变体。采用组织学染色（HE）、荧光免疫组化（IF）、荧光原位杂交、real-time PCR等方法,分析了各突变体性腺表型和基因表达情况,并尝试使用外源雌激素（17β-estradiol,E2）和芳香化酶抑制剂（Fadrozole）对突变鱼进行表型回救。最后,利用启动子分析、凝胶迁移（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等体外实验探究了dmrt1和foxl3之间的相互调控关系。并通过在dmrt1和foxl3突变体中敲降体细胞特异的foxl2,探究了生殖细胞基因和体细胞基因间的上下位关系。具体结果如下:1、尼罗罗非鱼foxl3细胞定位和功能研究。性腺转录组测序结果表明,foxl3在孵化后30天（days after hatching,dah）XX罗非鱼卵巢中表达最高,而不在精巢中表达。荧光原位杂交和生殖细胞标记Vasa共定位结果显示,foxl3 m RNA主要定位于卵巢卵原细胞中,精巢组织中检测不到foxl3的表达。通过CRISPR/Cas9成功突变尼罗罗非鱼foxl3并获得缺失5bp和7bp的两种纯合突变体。组织学检测发现,120 dah天foxl3突变XY鱼精巢发育正常。而foxl3突变XX鱼性腺外形仍像正常卵巢,且存在卵巢的特征结构卵巢腔;但与对照XX鱼不同,foxl3突变XX性腺中不存在卵母细胞而是含有各级生精细胞。这表明foxl3突变导致XX性腺中生殖细胞起始了精子发生。荧光原位杂交和荧光免疫组化结果显示,foxl3突变XX性腺中存在精子细胞（表达Sox30）,而不存在卵母细胞（不表达bmp15和42Sp50）。荧光免疫组化结果显示,突变性腺体细胞中表达雌激素合成的关键酶Cyp19a1a,而不表达雄激素合成酶Cyp11c1。血清激素测定结果表明,foxl3突变XX鱼血清雌激素水平与对照XX雌鱼相比显着降低,但仍然显着高于对照XY雄鱼。与对照XX雌鱼一致,foxl3突变XX鱼血清雄激素（11-ketotestosterone,11-KT）水平很低。表明foxl3突变XX性腺中生殖细胞在雌性化的体细胞环境中进行了精子发生。Real-time PCR结果证实了foxl3突变性腺中体细胞的雌性化环境和生殖细胞中进行的精子发生。值得注意的是,雄性特异基因dmrt1在foxl3突变XX性腺中有显着的升高。另一方面,foxl3的突变不影响XY鱼性腺精子发生过程和育性。2、尼罗罗非鱼dmrt1的表达模式和功能研究。90 dah时,荧光原位杂交结果显示,罗非鱼dmrt1 m RNA定位于精巢中精原细胞、初级精母细胞和支持细胞（Sertoli cell）中,卵巢中没有检测到dmrt1的表达。利用设计的高效CRISPR/Cas9g RNA靶点成功在1号外显子突变尼罗罗非鱼dmrt1,获得缺失2 bp和5 bp的两种纯合突变体。60 dah时组织学检测发现,所有dmrt1突变XY鱼发生了由雄向雌的性逆转,其性腺发育为卵巢。免疫荧光结果表明,dmrt1纯合突变XY鱼性腺中表达雌激素合成酶Cyp19a1a,不表达雄激素合成酶Cyp11c1。成年期dmrt1突变鱼卵子发生正常,性腺中存在有卵黄的卵母细胞。性别决定关键时期4 dah时,免疫荧光结果显示,罗非鱼性别决定基因amhy的表达在XY dmrt1突变性腺不受影响,而另一个重要的dmrt1下游雄性通路基因Gsdf不表达,表明dmrt1突变鱼发生了原发性逆转。孵化后15天时,dmrt1突变XY性腺中可检测到Cyp19a1a的表达。这些结果证实在雄性通路中,dmrt1位于amhy和gsdf之间,也就是说,尼罗罗非鱼雄性通路由amhy-dmrt1-gsdf构成。3、尼罗罗非鱼dmrt1;foxl3双基因突变系的建立及表型分析。利用dmrt1杂合突变XY鱼和foxl3杂合突变XX鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双杂合突变XX和XY后代。进一步通过双杂合突变鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变后代。60 dah时组织学观察发现,dmrt1;foxl3双突变XX鱼性腺生殖细胞发育为卵母细胞,表明dmrt1的缺失回救了XX foxl3突变体生殖细胞性逆转的表型。另一方面,dmrt1;foxl3双突变XY鱼性腺发育为精卵巢,性腺中除卵母细胞外,还存在精母细胞,表明突变foxl3部分回救了XY dmrt1突变体生殖细胞的表型。荧光免疫组化结果显示,双突变性腺中有明显的Cyp19a1a表达。双突变XX/XY鱼血清雌激素水平和对照XX鱼接近。这些结果提示,dmrt1和foxl3在生殖细胞性别命运决定过程中存在相互拮抗的作用。4、尼罗罗非鱼Dmrt1和Foxl3相互调控影响生殖细胞可塑性。Dmrt1和Foxl3双突变鱼生殖细胞性别的相互回救促使我们进一步检测dmrt1在foxl3突变XX性腺中的表达和foxl3在dmrt1突变XY性腺中的表达。RT-PCR、real-time PCR和Western blot结果证实foxl3突变XX性腺中dmrt1在m RNA和蛋白水平显着升高。荧光原位杂交结果显示,dmrt1主要定位于foxl3突变XX性腺中生殖细胞,而不在对照XX卵巢中表达。另一方面,real-time PCR结果显示,dmrt1突变XY性腺中foxl3表达量显着升高。荧光原位杂交结果表明,30 dah时dmrt1突变XY性腺中生殖细胞表达foxl3,而对照XY性腺生殖细胞中不表达foxl3。进一步的调控实验证实,在HEK293细胞中,Dmrt1和Foxl3分别以剂量依赖的方式下调foxl3和dmrt1的启动子活性。删除或突变相应的启动子上结合位点,可以去除两者之间的抑制效果。凝胶迁移和染色质免疫共沉淀实验分析表明,Dmrt1和Foxl3可以在体外直接结合foxl3和dmrt1启动子上相应的结合位点。这些结果表明,Dmrt1和Foxl3通过直接结合对方启动子发挥转录抑制作用。利用外源雌激素处理对foxl3突变鱼进行回救。结果显示,E2处理1个月后foxl3杂合突变XY鱼性腺发育为卵巢,而foxl3突变XX鱼性腺中生殖细胞仍进行精子发生,不能诱导卵母细胞产生。表明foxl3是生殖细胞中雌激素下调dmrt1诱导卵母细胞发育所必须的关键基因。采用芳香化酶抑制剂（Fadrozole,aromatase inhibitor,AI）回救dmrt1突变鱼。结果显示,同批处理的dmrt1杂合突变XX鱼发生性逆转,而处理的dmrt1突变XX/XY鱼性腺仍发育为卵巢。Real-time PCR结果显示,AI处理后dmrt1突变性腺中foxl3表达水平与对照雌鱼接近。这些结果表明,AI诱导的由雌向雄的性逆转依赖于dmrt1的存在。突变foxl3或dmrt1后导致的性逆转不能被雌激素或芳香化酶抑制剂回救,表明生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。不同的是,双突变dmrt1;foxl3后再使用AI处理,双突变XX/XY鱼性腺发育为精巢,性腺中不存在卵母细胞。表明突变foxl3后再抑制雌激素合成,能够回救Dmrt1缺失造成的性逆转。此外,AI处理foxl3突变XX鱼后,其性腺发育为正常精巢。前期研究结果表明,敲降或敲除foxl2会导致XX罗非鱼发生性逆转。AI处理的dmrt1突变性腺仍发育为卵巢,这可能是由于foxl2不能被有效抑制所致。在dmrt1突变鱼中敲降foxl2后,dmrt1;foxl2双突变XX/XY性腺发育为精巢,但生殖细胞数目显着减少,且不能起始精子发生。表明dmrt1对于生殖细胞的存活和精子发生的起始是必需的。综上所述,尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3分别表达于精巢和卵巢组织中,体外实验证实二者间存在直接的转录抑制。突变dmrt1或foxl3分别导致由雄向雌和生殖细胞由雌向雄的性逆转。双突变体表型分析证实,dmrrt1和foxl3在尼罗罗非鱼生殖细胞性别命运决定过程中起着相互拮抗的作用。外源雌激素和芳香化酶抑制剂回救实验表明,罗非鱼生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。敲降foxl2后,foxl3和dmrt1单突变性腺都发育为精巢,但缺失dmrt1导致精子发生不能正常起始。本研究解析了尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3在雌雄性别分化和生殖细胞性别命运决定过程中的关键功能,揭示了dmrrt1和foxl3通过直接的转录抑制作用相互拮抗,决定生殖细胞性别的分子机制,丰富了我们对脊椎动物性别分化和生殖细胞性别决定的认识。
龙嘉航,张浓,谢新民,曾聪,向建国,潘望城[3]（2020）在《两栖动物性染色体的多样性及其进化机制的研究进展》文中进行了进一步梳理两栖动物性别决定类型和性染色体具有多样性的特点。在已发现异形性染色体两栖动物中,大部分物种Y或W染色体大于其对应的X或Z染色体,少数物种具有高度分化的Y或W染色体。同时两栖动物类群内基因组大小差异大,性染色体间分子水平上也存在差异。高频转换、偶然重组和染色体重排可能是两栖动物性染色体进化过程中的关键机制。本综述通过对两栖动物性染色体进化的深入探讨,揭示其遗传性别决定的机理,有助于对两栖动物性别人工调控的进一步探索。
刘芳[4]（2020）在《Foxl2基因在红耳龟温度依赖型性别决定中的功能研究》文中研究表明温度依赖型性别决定（temperature-dependent sex determination,TSD）是一种典型的表型可塑性现象,主要存在于一些爬行动物中,例如红耳龟（Trachemys scripta）、密西西比鳄鱼（Alligator mississippiensis）、豹纹守宫（Eublepharis macularius）等。这类爬行动物没有性染色体、根据孵化温度范围来决定个体性别,其中,红耳龟能在较小的孵化温度范围（26℃～32℃）内产出不同性别比率的后代。不同于研究较深入的基因型性别决定（genetic sex determination,GSD）（主要存在于哺乳动物和鸟类）,TSD的机制研究较为肤浅,许多谜团未被破解。本文对红耳龟性别决定机理展开研究,15期之前红耳龟性腺并未形成,随着性腺发育至热敏期（15-19期,也称性别决定时期）时,呈现出温度依赖性差异表达模式（如Dmrt1、Sox9、AMH等基因）。Foxl2作为一个遍布脊椎动物各门间高度保守的雌性基因,许多研究仅检测了Foxl2的表达模式,并未进行功能研究。本研究通过对红耳龟早期胚胎性腺进行转录组测序分析,筛选获得了性别决定和分化相关基因,并对Foxl2基因进行了克隆和表达分析。同时,通过基因功能缺失和获得分析,重点研究了Foxl2基因在红耳龟雌性性别决定和分化中的作用。以下为具体的研究结果:（1）红耳龟胚胎性腺转录组分析本研究选用红耳龟早期胚胎性腺组织,进行转录组测序,共构建了12个c DNA文库（F16和M16、F17和M17各3个）,经比对分析后,筛选条件设为padj<0.05,相对于FPT性腺,在第16和17期两性性腺中分别获得了差异表达基因474个和810个。其中,第16期FPT（female-producing temperature）性腺中上调的基因有193个,MPT（male-producing temperature）性腺中下调的基因有283个;17期中,显着上调基因数有412个,显着下调的有298个。根据GO富集和KEGG通路富集,分析差异基因的功能,并结合富集情况及其它脊椎动物中的相关报道,筛选到4个性别决定和性别分化相关基因（Foxl2、Dmrt1、Kdm6B、AMH）,其中Foxl2在第16和17期FPT性腺中的FPKM值明显大于MPT性腺。（2）Foxl2的c DNA序列克隆和表达分析采用RACE克隆技术,获得长度为2324 bp的Foxl2基因c DNA序列,其中,1～258 bp为5’非编码区（UTR）,1164～2324 bp为3’非编码区（UTR）为,259～1164bp为开放阅读框（ORF）为（共906 bp）,一共编码的氨基酸有301个。RT-PCR结果显示,Foxl2在成年卵巢组织中高度表达,肝脏、脾脏中也存在少量表达,但在睾丸、肾脏、肌肉中未见表达。q RT-PCR结果进一步证明Foxl2在成年卵巢中的表达量显着高于睾丸,而在一些组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉）中仅检测到微弱或未检测到Foxl2的表达信号。q RT-PCR分析结果显示Foxl2在处于热敏期第16和17期开始呈现FPT性腺特异性高表达,MPT性腺中始终维持低的表达水平,呈现典型的依赖温度的表达模式。此外,温度置换实验结果显示,MPT置换至FPT后的第3天,Foxl2表达量出现快速上调;经雌激素E2诱导处理后的第16和17期MPT胚胎性腺中,Foxl2基因表达量也发生明显地升高,表明Foxl2能够快速响应温度和性激素的变化。（3）Foxl2功能缺失和获得研究通过构建慢病毒Foxl2敲低和过表达载体系统并在性别分化前分别引入红耳龟FPT和MPT胚胎,实现了该基因的高效敲低和异位表达效应。组织形态学观察和分子水平研究结果表明,敲低Foxl2后的FPT性腺外形和组织结构明显雄性化,睾丸分化关键基因Dmrt1和Sox9表达明显上调,同时在雄性化的性腺髓质区检测到了大量的雄性蛋白AMH和SOX9的荧光信号,生殖细胞由皮质区迁移至髓质区,与雄性分布特征类似,此时FPT性腺发生了雌转雄性逆转现象。相反地,Foxl2过表达后的MPT性腺则向雌性方向分化,皮质区高度发育,髓质区退化,Dmrt1和Sox9表达显着下调,雌性分化关键基因Rspo1表达上升,AMH和SOX9蛋白表达几乎消失,生殖细胞完全分布在发达的皮质区,呈现雌性所具有的分布特征。以上研究结果充分表明Foxl2基因在红耳龟早期雌性性腺形成过程中是必需的关键调控因子,且能够充分启动雌性分化过程,位于TSD雌性信号通路上游位置。本研究首次鉴定了一个爬行动物雌性性别决定的雌性关键调控基因,为TSD分子机制的进一步解析奠定基础。
林小元[5]（2020）在《峨眉髭蟾蝌蚪自然生长发育的研究》文中研究说明绝大多数两栖动物的生活史都具有两个不同阶段,即水栖的蝌蚪时期和陆栖或者水陆两栖的成体时期。大多数两栖类生活史中存在变态发育现象,随着生态环境的变化,从幼体到成体的形态特征也发生很大的改变。当然成体也有很多特征沿袭自幼体,即成体的很多性状在幼体期就已经决定了。因此,两栖类的很多研究都需要考虑幼体的生长发育。峨眉髭蟾隶属于无尾目角蟾科拟髭蟾属,变态发育,它的蝌蚪期非常长。这样长的发育期对成体以及整个物种会带来怎样的影响呢?它背后的机制又是什么呢?这些都是值得关注的问题,但是,首先我们需要对其蝌蚪发育有更全面的理解。因此,本研究以湖南省八大公山自然保护区青龙湾小溪的峨眉髭蟾蝌蚪作为研究对象,结合野外观察和形态解剖、组织切片等实验,全面的了解峨眉髭蟾蝌蚪的生长发育,为后续峨眉髭蟾的相关研究打基础。我们对青龙湾小溪里的峨眉髭蟾蝌蚪进行4个多月的野外观测。通过对其窝卵数、关键时期的发育时长、各时期体形大小、食性及活动节律性的研究来说明峨眉髭蟾蝌蚪自然生长发育情况。我们一共统计了 79团卵,平均窝卵数为265枚,各卵团之间的卵粒数量无显着性差异（P=0.486）。研究发现各时期的发育时长不均等,其中G1-G25期发育时长约75天,G42期历时约30天,G42-G46期发育时长约65天。通过对1181只峨眉髭蟾蝌蚪的体形测量与统计分析发现,各时期的体重、体长、尾长、体宽、尾宽均存在极显着差异（P<0.001）,G40期体重达到最大,G25-G40期体重随生长时期的增长而增加,G40期-G46期体重随时期增长而减轻;G41期尾长达到最大值,G42期开始尾部开始缩短;尾宽结果与尾长结果类似;G25-G38期头部逐渐变宽,在第G38期达到最大,之后便逐渐减小。此外,我们发现其活动习性为昼伏夜出。对其内部器官的研究主要采用室内解剖和组织切片的方法。研究发现峨眉髭蟾蝌蚪大肠和小肠从G25期开始就已分化明显,G25-G40期大肠和小肠的肠形无变化,体积随体形的增大而增大。G25-G40期峨眉髭蟾蝌蚪消化道无明显变化,这可能与其食性较为一致,均为杂食性有关。脂肪体在G25期开始就已分化明显,此时期脂肪体呈细长的亮黄色条带状,G25-G40期,脂肪体的体积随时期的增长而变大,G27期,脂肪体发育为指状,此时期指状分支少且短;随着时期的增长,脂肪体的分支变多和变长,脂肪体的体积也随之变大。G25-G40期蝌蚪（n=72）的性腺切片实验表明,峨眉髭蟾蝌蚪性腺在G25期精巢和卵巢已明显分化,分化为卵巢的数量35只,分化为精巢的数量为33只,雌、雄比例接近1。由于在G25-G40期每一时期均切出精巢和卵巢,我们推测峨眉髭蟾蝌蚪性腺的分化模式偏向于分化型。总体而言,虽然峨眉髭蟾的蝌蚪发育耗时三年,但是部分器官的发育比较快。蛾蚪的消化道在G25期已经发育完成,性腺在G25期之前已经完成分化,脂肪体在G25期发育为细条带状,G27期发育成指状。这些结果为我们后期将要进行的峨眉髭蟾相关研究打下了基础。
刘蕊,刘春晓,刁金玲,周志强[6]（2019）在《农药类内分泌干扰物对无尾两栖动物影响的研究进展》文中研究指明农药类内分泌干扰物（endocrine disrupting chemicals, EDCs）对人类健康和生态环境造成了一定威胁。无尾两栖动物因其处于水生生态系统和陆生生态系统的过渡阶段,在食物链中具有重要位置,同时也是经济合作与发展组织（OECD）和美国环保局（USEPA）识别和评估化合物影响的常见模式生物。因此开展农药类EDCs对无尾两栖动物影响的研究可进一步评价农药的生态风险,有助于全面认识农药类EDCs。本文综述了农药类内分泌干扰物对无尾两栖动物甲状腺及性腺干扰的研究进展,并展望了研究农药类EDCs对无尾两栖动物影响的深远意义,旨在为全面的农药生态风险评价及为农药安全性评价体系引入更加全面、科学的试验方法和评价标准提供科学依据。
王兵霞[7]（2019）在《水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响及Wnt4基因的表达分析》文中指出两栖动物的性腺分化是当今发育生物学的研究热点。两栖动物属于变温动物,其生长和性腺分化均受到环境温度的影响,研究温度对两栖动物的生长和性腺分化的影响,对于两栖动物保护具有重要的理论价值。本文在大鲵（Andrias davidianus）幼体适宜生长的水温范围内,设置了 14℃、21℃、24℃等3个水温梯度,分3次测量每个水温梯度下大鲵幼体的体重,采用石蜡切片、HE染色技术对其进行性别鉴定,旨在探究水温对大鲵幼体生长与性腺分化的影响。在性别鉴定的同时,依据本实验室高通量转录组测序数据筛选出的差异表达基因,选取了与性别分化相关的基因Wnt4,采用原位杂交技术对Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达进行了定位,还运用实时定量PCR技术、Western Bolt技术对Wnt4 的表达进行了定量,以此来探究Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达差异及水温变化对Wnt4表达量的影响。主要结果与结论如下:1.水温对大鲵幼体生长的影响。大鲵幼体在14℃水温下生长最慢,24℃次之,21℃最快;在3个水温梯度条件下,大鲵幼体生长速度差异显着（P<0.05）。表明在14℃～2 1℃水温范围内,大鲵幼体的生长速率随水温的升高而加快,但水温高于2 1℃对大鲵幼体的生长有抑制作用。2.水温对大鲵幼体性腺分化比例的影响。14℃水温组取材的9尾大鲵幼体为3♀6♂,雌雄性别比为1:2,雌性率为33%。21℃和24♂水温组取材的9尾大鲵幼体都为3♀6♂雌雄性别比均为2:1,21℃、24℃两组大鲵的雌性率均显着升高至67%。表明高水温可使大鲵幼体性腺分化趋向于雌性,而低水温可使大鲵幼体的性腺分化趋向于雄性。3.水温对大鲵幼体性腺分化时间的影响。在3个水温梯度下,出膜约327 d的大鲵幼体性腺的分化时间差异较大:①14℃水温组的部分大鲵幼体性腺初步分化出原始卵泡,个别大鲵幼体的性腺还未出现分化。②21℃、24℃水温组大鲵幼体的性腺已全部分化且分化程度明显。本文认为,大鲵幼体的性腺分化对水温的变化较为敏感,高水温可使其性腺的分化时间提前,分化进程加快。4.Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的定位分析。Wnt4 mRNA在14℃水温组卵巢中的强阳性表达主要集中在卵巢边缘的体细胞以及与卵巢相连的肾小管上皮细胞,Wnt4 mRNA在精巢中的表达强度较弱,表达部位主要集中在与精巢相连接的肾髓质、皮质交界处的肾小管细胞中;Wnt4 mRNA在24℃水温组卵巢中的强阳性表达主要集中在卵泡细胞中,同时在与卵巢相连的肾小管细胞内也有强阳性表达,Wnt4mRNA在精巢中的阳性表达主要集中在精巢基部接近中肾处非成熟区的精原细胞和体细胞、生精小叶内的精原细胞以及精巢横切面中部结缔组织的体细胞。5.Wnt4 mRNA在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达量分析。实时定量PCR法检测Wnt4 mRNA的表达量由高到低的顺序为:14℃雌鲵>21℃雌鲵>21℃雄鲵>24℃雌鲵>24℃雄鲵>14℃雄鲵。14℃水温组的Wnt4mRNA的表达量在雌鲵和雄鲵之间差异显着（P<0.05）,且Wnt4 mRNA在雌鲵中的表达量约为雄鲵的2倍。而对于21℃和24℃两组而言,Wnt4mRNA的表达量在雌鲵和雄鲵之间差异均不显着（P>0.05）。Wnt4mRNA在14℃雌鲵中表达量最高,14℃雄鲵中表达量最低。且在同一水温条件下,Wnt4mRNA在大鲵幼体雌鲵中的表达量始终高于雄鲵。因此,本文认为Wnt4的表达与大鲵幼体卵巢的发育以及功能维持密切相关。6.Wnt4蛋白在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达量分析。Western Bolt结果表明Wnt4蛋白表达量由高到低的顺序依次为:14℃雌鲵>14℃雄鲵>21℃雄鲵>24℃雌鲵>21℃雌鲵>24℃雄鲵。同一水温条件下,Wnt4蛋白在14℃、21℃两组大鲵幼体雌鲵和雄鲵之间表达量差异皆为极显着（P<0.01）,24℃水温组雌鲵和雄鲵之间表达量差异显着（P<0.05）。同一水温条件下,在14℃、24℃两组中,Wnt4蛋白在雌鲵中的表达量高于雄鲵,但21℃水温组Wnt4蛋白在雄鲵中的表达量要高于雌鲵,且差异极显着（P<0.01）。基于此,本文认为Wnt4的表达不具有性别特异性,Wnt4不仅参与大鲵幼体卵巢的发育过程,同时也是大鲵幼体精巢发育途径中的一部分。7.水温变化对Wnt4表达量的影响。本文的研究表明14℃水温组的大鲵幼体的性腺分化尚未成熟,在该温度条件下Wnt4 mRNA以及Wnt4蛋白在卵巢中的表达量最高。随着水温的升高,大鲵幼体性腺的分化更为成熟,但Wnt4 mRNA以及Wnt4蛋白的表达量均降低,因此,本文推测Wnt4在大鲵幼体卵巢发育的早期发挥更重要的作用。
殷子旋[8]（2018）在《两栖类Dmrt相关基因的克隆与进化分析》文中指出Dmrt（Doublesex and mab-3 related transcription factor）基因家族是一类编码转录调控因子的超家族,主要参与脊椎动物的性别分化、性腺发育、配子发生、组织器官形成和功能维持等过程。它编码的转录因子都具有一个保守的DM功能结构域,依靠锌指结构与DNA结合。Dmrt基因家族是目前脊椎动物研究性别决定和分化发育最关键的一类基因家族,而Dmrt1基因也是研究最多并与性别发育分化最相关的一个基因。两栖类作为从水栖向陆栖过渡的一大脊椎动物类群,其复杂的生活习性和独特的繁殖方式使得两栖动物成为我们需要高度关注的群体。然而,与其他脊椎动物相比,两栖类关于性别决定和分化的研究明显滞后。因此我们选取两栖类有尾目和无尾目的6个代表物种,有尾目为巫山北鲵（Ranodon shihi）和红瘰疣螈（Tylototriton shanjing）,无尾目为峨眉树蛙（Rhacophorus omeimontis）、华西雨蛙（Hyla annectans）、雷山髭蟾（Vibrissaphora leishanensis）和中华蟾蜍（Bufo gargarizans）,作为研究对象来进行两栖类Dmrt相关基因的克隆和进化分析。我们得到如下结果:（1）克隆得到6个物种的Dmrt1基因、雷山髭蟾和巫山北鲵的Dmrt2基因和华西雨蛙的Dmrt3基因的DM结构域序列,序列比对发现三个基因DM域的同源性达到80%以上,系统发生显示在进化上相当保守。（2）利用SMART-RACE技术成功获得了 6个物种Dmrt1基因的cDNA全长序列,均得到完整的开放阅读框和相关功能结构域,可以进行结构、功能和进化分析。其中巫山北鲵全长1,656 bp,开放阅读框1,020 bp,编码339个氨基酸序列;红瘰疣螈全长1,686 bp,包含1,032 bp的开放阅读框,编码343个氨基酸序列;峨眉树蛙全长1,917bp,包含918 bp的开放阅读框,编码305个氨基酸序列;华西雨蛙全长1,938 bp,开放阅读框1,023 bp,编码340个氨基酸序列;雷山髭蟾全长1,194 bp,包含945 bp的开放阅读框,编码314个氨基酸序列;中华蟾蜍全长1,141 bp,包含1,044 bp的开放阅读框可编码347个氨基酸序列。功能域分析显示所有Dmrt1基因均具有DM保守结构域和Dmrt1功能结构域,信号肽检测未发现相关的信号肽切割位点,且Dmrt1为非分泌蛋白和亲水性蛋白。蛋白质二级结构包括α螺旋、延伸链和无规卷曲,DM域三级结构预测的最佳匹配模板为4yj0.1.A,并具有明显的锌指结构。（3）多个物种之间的成对氨基酸距离大于成对核苷酸距离,说明可能存在适应性选择。通过PAML软件codeml子程序对两栖动物的Dmrt1基因进行正选择检测,多种模型只检测到1个氨基酸位点受到显着的正选择作用。虽然检测到的正选择作用较弱,但根据其保守序列同源性较高,推测可能受到基因复制的影响。而且两栖类性染色体在漫长的进化过程中会发生重组,对于Dmrt1基因的进化也会产生影响。（4）对雷山髭蟾雌雄成体的精巢、卵巢、肝脏、心脏、肾和脾组织的Dmrt1表达量进行荧光定量PCR测定,发现Dmrt1基因在雄性精巢表达量显着高于在其他组织的表达量,暗示Dmrt1基因可能与雷山髭蟾雄性性腺发育分化有关。具体性别决定作用有待进一步探索。综合以上结果,Dmrt基因家族是一类在进化上高度保守的基因,同形性染色体的重组和基因复制会对Dmrt1基因的正选择产生影响。同时Dmrt1基因的表达具有显着的雄性特异性,是一个研究两栖类性别决定的良好候选基因。
黄棨通[9]（2018）在《康县隆肛蛙Feirana kangxianensis种群生态学研究》文中进行了进一步梳理康县隆肛蛙Feirana kangxianensis隶属于无尾目、叉舌蛙科、隆肛蛙属,是仅分布于我国甘肃省陇南山地康县山区的特有两栖类物种。由于两栖类动物对环境极具敏感性,被誉为环境变化的指向标,并且该物种分布区处于我国动物地理东洋界和古北界物种相互渗透的通道之一,因而本文在康县豆坝乡野外工作的基础上,对我国这一特有物种的种群生态学进行了相关研究,旨在为保护我国特有两栖类动物做相关基础工作,为后续研究我国特有两栖类物种的研究提供基础资料。本研究以野外工作为基础,采用样线法、直接计数法（捕捉法）等调查方法,对康县隆肛蛙以及蝌蚪的生物学特征进行了相关研究,并对康县隆肛蛙越冬栖息地的选择进行了相关研究及分析。又结合“生物多样性专项”中对康县两栖动物监测的成果,将2014-2017年康县隆肛蛙种群数量的变化情况以及种群密度进行计算分析,并于2017年共计采集161只康县隆肛蛙样本（雌性:73只;雄性:68只;幼体:20只）,测量其各项形态指标用以进行相关年龄组划分、肥满度以及两性异形的研究。本文首先分析了康县隆肛蛙及其蝌蚪的生物学的特征,了解了康县隆肛蛙在越冬期间生境因子的主要偏好,掌握了康县隆肛蛙蝌蚪的唇齿式以Ⅱ:5+5/1+1:Ⅱ最为常见;对该物种越冬起关键性的因素包括:水温、距离道路、植被盖度、林缘距离等。其次,本文以调查数据为支撑,分析了种群数量、密度的变化,并对各样地种群数量进行了聚类分析。结果表明:康县隆肛蛙种群数量每年6月份最多;且其平均种群密度呈现逐年增加趋势:38.67只/hm2（2017年）>33.03只/hm2（2016年）>31.00只/hm2（2015年）>29.20只/hm2（2014年）;而人类农业活动引起的环境污染以及道路建设则是导致康县隆肛蛙种群数量减少的原因之一。其次,本文分析了康县隆肛蛙种群年龄组的划分以及年龄组的结构,较为深入的探讨了康县隆肛蛙种群年龄结构的组成;在基于形态特征量度数据的基础上,研究了该物种各年龄组的性别比例、肥满度指数和体重/头体长指数的差异。结果表明:康县隆肛蛙的头体长SVL与其体重间呈正相关性;利用聚类分析以及T检验分析后可将年龄组分为5组;总体性比♀:♂=1.07:1,而绘制年龄结构椎体图得知该物种为小幅度增长型种群。肥满度指数在4月份最大;体重/头体长比Kwl平均值在4月份最小、6月份最大;说明4月份康县隆肛蛙刚刚结束冬眠状态逐渐苏醒,其所储存的营养物质已基本消耗完,因而会摄取较多的食物用以补充体能。最后,本文也借助SPSS 23.0软件对康县隆肛蛙两性异形现象进行了研究。研究发现:康县隆肛蛙雌性个体略大于雄性;且雌性个体平均头体长大于雄性平均头体长,可认为该物种为两性异形程度较小的两栖类动物。雌性的头长等4个形态特征在个体生长到某一阶段后其生长速度会逐渐大于雄性;雄性的眼径以及鼓膜长在生长到某一阶段后其生长速率会逐渐快于雌性;两性的吻长等3个形态特征生长速率较为接近。生育力选择假设则能更好的解释康县隆肛蛙的两性异形现象,而导致其出现差异的原因则可能是:较大体形的雌性能提高产卵率以及生存率,而较小体形的雄性则有利于减轻雌性的繁殖负重以及死亡率。
唐韵,胡英超,郑乐舟,丁国骅,林植华[10]（2017）在《两栖动物的性别决定和分化》文中进行了进一步梳理性别发育是进化生物学领域备受关注的研究热点之一。性别发育主要包括性别决定和性别分化,脊椎动物的性别决定主要分为基因性别决定和环境性别决定两种模式。两栖动物的性别决定属于基因型性别决定模式,其基因型性别由受精时两性配子的性染色体决定,但性腺分化所产生的表型性别还会受环境温度和性激素的修饰。在两栖动物中性别逆转的现象普遍存在,其相关的生理和分子机制也有一定的研究。本文从性别相关基因对性别决定的影响、温度对两栖动物性别分化的影响、性激素对两栖动物性别分化的影响、温度和性激素对性别相关基因表达的影响等四方面对两栖动物性别决定和性别分化的生理和分子机制进行一定的概述,并提出了未来两栖动物性别发育研究的重点。
二、两栖动物性别决定的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、两栖动物性别决定的研究进展（论文提纲范文）
（2）Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 脊椎动物性腺发育 |
| 1.1 生殖细胞的来源 |
| 1.2 生殖细胞的迁移与原始性腺的形成 |
| 2 脊椎动物性别决定 |
| 2.1 脊椎动物性别决定方式 |
| 2.2 脊椎动物生殖细胞的性别决定 |
| 3 脊椎动物性别分化 |
| 3.1 哺乳动物性别分化 |
| 3.2 鸟类性别分化 |
| 3.3 爬行类性别分化 |
| 3.4 两栖类性别分化 |
| 3.5 鱼类性别分化 |
| 4 Dmrt家族基因与性别分化 |
| 4.1 Dmrt1 |
| 4.2 Dmy/dmrt1bY |
| 4.3 Dm-w |
| 5 Fox家族基因与性别分化 |
| 5.1 Foxl2 |
| 5.2 Foxl3 |
| 6 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 7 本研究的技术路线 |
| 第2章 尼罗罗非鱼foxl3 在生殖细胞性别命运决定中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼foxl3 序列进化分析和性腺表达模式 |
| 3.2 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变导致卵巢中出现精子发生 |
| 3.4 尼罗罗非鱼XX foxl3 纯合突体性腺体细胞维持雌性环境 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3 特异表达于雌性生殖细胞中 |
| 4.2 尼罗罗非鱼foxl3 决定XX个体性腺生殖细胞性别命运 |
| 第3章 尼罗罗非鱼dmrt1 在雄性性别分化中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼dmrt1 在精巢中的细胞定位 |
| 3.2 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变导致由雄向雌的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼dmrt1 表达于精巢支持细胞和生殖细胞 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 是精巢分化所必需的 |
| 第4章 尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3 相互拮抗研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 双突变dmrt1;foxl3 导致性腺发育为精卵巢 |
| 3.2 尼罗罗非鱼Foxl3 直接抑制dmrt1 的转录 |
| 3.3 尼罗罗非鱼Dmrt1 直接抑制foxl3 的转录 |
| 3.4 外源雌激素不能回救foxl3 突变导致的生殖细胞性逆转 |
| 3.5 阻断雌激素合成无法回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 3.6 阻断雌激素合成导致foxl3 突变性腺完全雄性化 |
| 3.7 阻断雌激素合成导致dmrt1;foxl3 双突变性腺雄性化 |
| 3.8 敲降foxl2 成功回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3与dmrt1 相互拮抗决定生殖细胞性别命运 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 拮抗foxl2/cyp19a1a决定性腺分化方向 |
| 4.3 体细胞环境对生殖细胞性别命运的影响 |
| 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的主要论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（3）两栖动物性染色体的多样性及其进化机制的研究进展（论文提纲范文）
| 1 两栖动物的性别决定机制 |
| 2 两栖动物性染色体结构的多样性 |
| 2.1 大型Y和W染色体 |
| 2.2 小型Y和W染色体 |
| 3 两栖动物性染色体的分子差异 |
| 4 两栖动物性染色体进化的机制 |
| 4.1 高频转换 |
| 4.2 偶然重组（以XX/XY型系统为例） |
| 4.3 染色体重排 |
| 5 总结与展望 |
（4）Foxl2基因在红耳龟温度依赖型性别决定中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 脊椎动物类性别决定 |
| 1.1.1 哺乳动物类性别决定 |
| 1.1.2 鸟类性别决定 |
| 1.1.3 爬行动物类性别决定 |
| 1.1.4 两栖动物类性别决定 |
| 1.1.5 鱼类性别决定 |
| 1.2 Foxl2在脊椎动物性别决定中的研究进展 |
| 1.3 Foxl2在爬行动物中的研究进展 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 第二章 红耳龟性腺转录组分析 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验仪器和主要试剂 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.3.1 性腺组织RNA提取、cDNA文库构建及测序 |
| 2.1.3.2 测序数据质量评估分析 |
| 2.1.3.3 基因表达水平的量化 |
| 2.1.3.4 差异表达分析 |
| 2.1.3.5 差异表达基因GO富集分析 |
| 2.1.3.6 KEGG通路富集分析 |
| 2.1.3.7 性别决定和性别分化相关基因的筛选 |
| 2.1.3.8 部分性别发育相关基因的验证 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 测序数据质量评估 |
| 2.2.3 差异表达基因分析 |
| 2.2.4 性腺差异表达基因GO富集、KEGG分析 |
| 2.2.5 筛选性别决定和性别分化相关基因 |
| 2.2.6 部分性别发育相关基因的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 红耳龟Foxl2 基因的cDNA克隆和表达分析 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验仪器和主要试剂 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.3.1 各组织RNA提取及cDNA合成 |
| 3.1.3.2 第一链cDNA合成 |
| 3.1.3.3 TA克隆 |
| 3.1.3.4 菌液PCR检测和送样测序 |
| 3.1.3.5 Foxl2基因序列拼接及生物信息学分析 |
| 3.1.3.6 半定量PCR和实时荧光定量PCR |
| 3.1.3.7 数据分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 红耳龟Foxl2 基因的cDNA全长克隆、同源性分析 |
| 3.2.2 Foxl2在红耳龟不同组织中的表达分析 |
| 3.2.3 Foxl2在红耳龟不同胚胎时期性腺中的表达分析 |
| 3.2.4 Foxl2关于温度的敏感性分析 |
| 3.2.5 雌二醇E2诱导的性逆转中Foxl2的表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Foxl2的功能研究 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验仪器和主要试剂 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.3.1 Foxl2慢病毒载体的构建及龟胚侵染 |
| 4.1.3.2 RNA提取cDNA合成 |
| 4.1.3.3 实时荧光定量PCR |
| 4.1.3.4 石蜡切片 |
| 4.1.3.5 苏木素-伊红(H&E)染色 |
| 4.1.3.6 免疫荧光染色 |
| 4.1.3.7 数据分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 Foxl2功能缺失研究 |
| 4.2.1.1 Foxl2-慢病毒载体干扰后的有效性分析 |
| 4.2.1.2 Foxl2 基因敲低后FPT性腺组织形态学变化 |
| 4.2.1.3 Foxl2 基因敲低后FPT性腺雄性特异性基因表达变化 |
| 4.2.1.4 Foxl2 基因敲低后FPT性腺生殖细胞分布变化 |
| 4.2.2 Foxl2功能获得研究 |
| 4.2.2.1 Foxl2 基因过表达后MPT性腺组织形态学变化 |
| 4.2.2.2 Foxl2 基因过表达后MPT性腺雄性特异性基因表达变化 |
| 4.2.2.3 Foxl2 基因过表达后MPT性腺生殖细胞分布变化 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 小结与展望 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 本文的创新点 |
| 5.3 本文的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 科研成果及资助单位(人) |
| 致谢 |
（5）峨眉髭蟾蝌蚪自然生长发育的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 两栖类的发育 |
| 1.2 无尾目的一般发育模式 |
| 1.2.1 整体外形 |
| 1.2.2 口部 |
| 1.2.3 消化道 |
| 1.2.4 性腺 |
| 1.3 无尾目发育的相关研究 |
| 1.3.1 发育时长差异的研究 |
| 1.3.2 两栖类性腺发育研究 |
| 1.4 研究对象 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验地点和实验材料 |
| 2.2 野外数据收集 |
| 2.2.1 峨眉髭蟾窝卵数统计 |
| 2.2.2 关键时期发育时长统计 |
| 2.2.3 各时期体形数据收集 |
| 2.2.4 食性及活动节律性观察 |
| 2.3 室内实验数据收集 |
| 2.3.1 口部外形特征观察 |
| 2.3.2 消化道发育 |
| 2.3.3 脂肪体发育 |
| 2.3.4 性腺组织发育 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 野外观测分析结果 |
| 3.1.1 窝卵数统计结果 |
| 3.1.2 关键时期发育时长结果 |
| 3.1.3 体形特征测量结果 |
| 3.1.4 食性和活动节律性观察结果 |
| 3.2 解剖与切片实验结果 |
| 3.2.1 口部外形特征 |
| 3.2.2 消化道发育 |
| 3.2.3 脂肪体发育 |
| 3.2.4 性腺发育 |
| 3.2.5 性腺切片结果 |
| 4 讨论和展望 |
| 4.1 峨眉髭蟾蝌蚪的发育时长 |
| 4.2 口部外形结构 |
| 4.3 峨眉髭蟾蝌蚪性腺发育模式 |
| 4.4 影响峨眉髭蟾生长发育的因素 |
| 4.5 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响及Wnt4基因的表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 两栖动物的性别发育 |
| 1.2 温度对动物生长和性腺分化的影响 |
| 1.3 外源性激素对性腺分化的影响 |
| 1.4 性别相关基因对性腺分化的影响 |
| 1.5 Wnt4的研究现状 |
| 1.6 大鲵性腺的研究现状 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第2章 水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同水温对大鲵幼体生长发育的影响 |
| 2.2.2 不同水温梯度组大鲵幼体的性腺分化比例、分化时间 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 水温对大鲵幼体生长发育的影响 |
| 2.3.2 水温对大鲵幼体性腺分化比例、分化时间的影响 |
| 第3章 Wnt4基因在大鲵幼体性腺中的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 仪器与试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同水温处理组总RNA的质量 |
| 3.2.2 cDNA质量的验证 |
| 3.2.3 PCR扩增产物序列 |
| 3.2.4 蓝白斑筛选、质粒线性化以及探针的制备 |
| 3.2.5 质粒测序 |
| 3.2.6 质粒线性化 |
| 3.2.7 探针的合成 |
| 3.2.8 荧光实时定量PCR法检测Wnt4基因的表达量 |
| 3.2.9 灰度分析 |
| 3.3 Wnt4mRNA在大鲵幼体性腺中的原位杂交 |
| 3.3.1 14℃水温组Wnt4 mRNA的原位杂交 |
| 3.3.2 24℃水温组Wnt4 mRNA的原位杂交 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Wnt4在大鲵精巢和卵巢中的表达特点 |
| 3.4.2 温度变化对Wnt4表达的影响 |
| 第4章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）两栖类Dmrt相关基因的克隆与进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 性别决定研究进展 |
| 1.2 两栖类的性别决定 |
| 1.2.1 两栖类的性染色体机制 |
| 1.2.2 两栖类的性别决定基因 |
| 1.2.3 两栖类性染色体和性别决定基因的进化 |
| 1.3 Dmrt基因家族的研究进展 |
| 1.3.1 Dmrt基因家族的结构 |
| 1.3.2 Dmrt基因家族的功能和进化 |
| 1.3.3 两栖类Dmrt1基因与性别决定及其进化机制 |
| 1.4 SMART-RACE技术简介 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 研究材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DM区引物和RACE引物设计 |
| 2.2.2 精巢组织总RNA的提取及RT-PCR |
| 2.2.3 Dmrt1、Dmrt2和Dmrt3基因DM区的克隆和测序 |
| 2.2.4 RACE cDNA的合成 |
| 2.2.5 Dmrt1基因5'RACE扩增和3'RACE扩增 |
| 2.2.6 Dmrt1基因RACE产物的克隆和测序 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.3 数据分析 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 总RNA的提取 |
| 3.2 DM区的扩增及序列分析 |
| 3.2.1 Dmrt1、Dmrt2和Dmrt3基因DM区序列扩增结果 |
| 3.2.2 Dmrt基因家族的氨基酸同源性分析 |
| 3.2.3 Dmrt基因家族的系统发生分析 |
| 3.3 Dmrt1基因的RACE扩增及序列分析 |
| 3.3.1 RACE扩增结果 |
| 3.3.2 功能结构域及蛋白质结构预测 |
| 3.3.3 氨基酸同源性分析 |
| 3.3.4 Dmrt1基因的系统发生分析 |
| 3.3.5 Dmrt1基因的选择作用检测 |
| 3.4 雷山髭蟾各组织Dmrt1基因的表达差异 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 两栖类Dmrt基因家族的保守性分析 |
| 4.2 两栖类Dmrt1基因的进化机制 |
| 4.2.1 系统发育树 |
| 4.2.2 选择作用与进化分析 |
| 4.3 两栖类Dmrt1基因与性别决定的相互联系 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）康县隆肛蛙Feirana kangxianensis种群生态学研究（论文提纲范文）
| 摘要Abstract第1章 研究综述 |
| 1.1 两栖类研究 |
| 1.1.1 两栖动物登陆进化特征 |
| 1.1.2 两栖动物种群受威胁分析 |
| 1.1.3 两栖动物种群生态学研究概况 |
| 1.2 隆肛蛙属的研究概况 |
| 1.2.1 隆肛蛙属分类学研究 |
| 1.2.2 隆肛蛙属形态学研究 |
| 1.2.3 隆肛蛙属分子生物学研究 |
| 1.3 康县隆肛蛙研究现状 |
| 1.3.1 康县隆肛蛙分类争议 |
| 1.3.2 康县隆肛蛙分类地位第2章 研究区概况 |
| 2.1 地理位置 |
| 2.2 气候特点 |
| 2.3 生物资源 |
| 2.3.1 植物资源 |
| 2.3.2 动物资源第3章 研究背景、方法及意义 |
| 3.1 选题背景 |
| 3.2 本研究课题的来源 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.3.1 研究方案 |
| 3.3.2 种群数量调查 |
| 3.3.3 种群动态研究 |
| 3.3.4 两性异形 |
| 3.3.5 越冬栖息地特征观察以及蝌蚪唇齿式 |
| 3.3.6 野外调查设备以及数据处理软件 |
| 3.4 研究目的及意义第4章 康县隆肛蛙生物学特征 |
| 4.1 成体生物学特征 |
| 4.2 蝌蚪生物学特征 |
| 4.3 越冬栖息地特征 |
| 4.3.1 越冬调查结果 |
| 4.3.2 越冬栖息地特点 |
| 4.3.3 越冬栖息地生境因子划分及主成分分析第5章 康县隆肛蛙种群特征 |
| 5.1 种群数量、密度研究 |
| 5.1.1 种群数量变化 |
| 5.1.2 种群密度变化与种群数量估算 |
| 5.1.3 人类活动对康县隆肛蛙干扰 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.2 种群年龄组划分及年龄组结构 |
| 5.2.1 调查结果 |
| 5.2.2 年龄组划分 |
| 5.2.3 年龄结构特征 |
| 5.2.4 讨论 |
| 5.3 种群生长状态研究 |
| 5.3.1 种群生长状态调查结果 |
| 5.3.2 体重、头体长各月份的分布 |
| 5.3.3 肥满度和重/长指标在月份间的差异 |
| 5.3.4 雌、雄两性间肥满度的差异 |
| 5.3.5 各年龄组间肥满度的差异 |
| 5.3.6 讨论 |
| 5.4 两性异形研究 |
| 5.4.1 形态量度调查结果 |
| 5.4.2 两性异形结果 |
| 5.4.3 讨论第6章 结论及后期工作 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 后期工作参考文献攻读硕士研究生期间取得的科研成果附图致谢 |
（10）两栖动物的性别决定和分化（论文提纲范文）
| 1 性别相关基因对性别决定的影响 |
| 1.1 SOX家族基因 |
| 1.2 DMRT家族基因 |
| 1.3 DAX1基因 |
| 2 温度和性激素对性别分化的影响 |
| 2.1 温度的作用 |
| 2.2 性激素的作用 |
| 3 温度和性激素对性别相关基因表达的影响 |
| 4 展望 |
四、两栖动物性别决定的研究进展（论文参考文献）
- [1]虎纹蛙表型变异的温度和芳香化酶抑制剂影响及性腺转录组学分析[D]. 唐韵. 南京师范大学, 2021
- [2]Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究[D]. 戴生飞. 西南大学, 2021
- [3]两栖动物性染色体的多样性及其进化机制的研究进展[J]. 龙嘉航,张浓,谢新民,曾聪,向建国,潘望城. 动物学杂志, 2020(04)
- [4]Foxl2基因在红耳龟温度依赖型性别决定中的功能研究[D]. 刘芳. 上海海洋大学, 2020(03)
- [5]峨眉髭蟾蝌蚪自然生长发育的研究[D]. 林小元. 华中师范大学, 2020(01)
- [6]农药类内分泌干扰物对无尾两栖动物影响的研究进展[J]. 刘蕊,刘春晓,刁金玲,周志强. 农药学学报, 2019(Z1)
- [7]水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响及Wnt4基因的表达分析[D]. 王兵霞. 陕西师范大学, 2019(06)
- [8]两栖类Dmrt相关基因的克隆与进化分析[D]. 殷子旋. 华中师范大学, 2018(01)
- [9]康县隆肛蛙Feirana kangxianensis种群生态学研究[D]. 黄棨通. 西北师范大学, 2018(06)
- [10]两栖动物的性别决定和分化[J]. 唐韵,胡英超,郑乐舟,丁国骅,林植华. 生态学杂志, 2017(09)