基于脂质体包封血红蛋白构建人工红细胞的工艺研究及其评价

论文摘要

全世界范围内血源紧张、病毒污染等问题推动了血液代用品的研究。输血来源有限,且输注后可能引起严重的不良反应,因而国内外科学家对以携氧液作为输血替代品进行了长达一个多世纪的探索。迄今为止,几种第一代红细胞代用品已经有望获准上市。各种产品有其独自的生理特性、生物活性和副作用。本研究主要从脂质体包封血红蛋白（liposome encapsulated hemoglobin,LEH）的角度出发,作为氧治疗剂进行研发,可能成为今后红细胞代用品研制的发展方向。关于本研究:目的:确定有效制备及鉴定微囊包被血红蛋白和微米级人工红细胞的方法。方法:首先通过低渗法制备高纯度、高浓度的膜蛋白,然后根据界面缩聚法的原理,利用匀速微囊制备喷头,将含有2 ,3-DPG、膜蛋白和血红蛋白水相直接滴入到含磷脂的植物油中,通过高速搅拌使囊心物（2 ,3-DPG与血红蛋白单体、二聚体构建的不稳定的四聚体）的周围形成单个球状膜壳型微囊。结果:微囊包被血红蛋白其微囊呈球状,表面光滑均匀,微囊直径2-5μm（电子显微镜下估算值）。人工红细胞透射电镜:单个包囊颗粒呈圆球状,有的表面光滑,有的表面稍有凹凸,平均粒径为3μm,最小粒径为1μm;扫描电镜显示:颗粒内部电子密度较高、不均匀,呈纤维状和细颗粒状交错分布,是为血红蛋白。人工红细胞的包埋率为53%,泄漏率在4℃生理盐水中15d释放40.9%。结论:双相乳化法可制备微米级人工红细胞,且具有携带和释放氧气及二氧化碳的生物活性。各种修饰血红蛋白、氟碳乳剂、血红蛋白微囊等技术迅速发展,其中一些已经形成规模化制备工艺。但目前,血液代用品没有完整的评价体系,全面评估血液代用品产品仍较困难。因此,本文另一个重要部分是以课题研究的血液代用品为基础,结合世界范围内的最新进展,从血液代用品的评价角度出发,探讨血液代用品的评价参数,围绕血液代用品的理化性质、有效性与安全性、保存条件等方面进行了说明。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 血液代用品发展及现状
• 1.2.2 目前血液代用品存在的问题
• 1.2.3 脂质体包封血红蛋白技术现状
• 1.2.4 小结
• 1.3 研究目的及研究意义
• 2 LEH 评价标准的建立
• 2.1 引言
• 2.2 国内外评价标准现状
• 2.3 标准参数的制定
• 2.3.1 携氧热力学参数P50
• 2.3.2 携氧动力学参数T50
• 2.4 评价标准的建立
• 2.4.1 外形
• 2.4.2 包封率
• 2.4.3 携氧能力
• 2.4.4 安全性
• 2.4.5 理化性质
• 2.4.6 稳定性
• 2.5 小结
• 3 人工红细胞制备材料选择与准备
• 3.1 引言
• 3.2 选择复乳法工艺构建人工红细胞的原因
• 3.3 膜蛋白的提取与分析
• 3.3.1 引言
• 3.3.2 膜蛋白与膜的结合方式
• 3.3.3 膜蛋白分离的基本原则
• 3.3.4 常用细胞破碎方法
• 3.3.5 红细胞质膜的分离
• 3.3.6 膜蛋白分离纯化的条件
• 3.4 血红蛋白的分离与提取
• 3.4.1 引言
• 3.4.2 牛血红蛋白
• 3.4.3 血红蛋白提取方法
• 3.5 蛋白质纯度检测——电泳技术
• 3.6 其他原料的选择
• 4 人工红细胞的制备
• 4.1 引言
• 4.2 主要仪器与试剂
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 试剂
• 4.3 产品制备
• 4.3.1 膜蛋白的提取
• 4.3.2 血红蛋白的提取
• 4.3.3 提取后蛋白的纯度分析（聚丙烯酰胺凝胶电泳）
• 4.3.4 人工红细胞制备方法
• 4.4 产品后处理
• 5 结果分析
• 5.1 引言
• 5.2 外形
• 5.2.1 仪器及步骤
• 5.2.2 结果
• 5.3 包封率的测定
• 5.3.1 仪器及步骤
• 5.3.2 结果
• 5.4 携氧能力测定
• 5.4.1 仪器与步骤
• 5.4.2 结果
• 5.5 安全性的检测*
• 5.5.1 仪器及步骤
• 5.5.2 结果
• 5.6 理化性质
• 5.6.1 仪器与步骤
• 5.6.2 结果
• 5.7 人工红细胞的稳定性测试
• 5.7.1 仪器及步骤
• 5.7.2 结果
• 5.8 最佳化条件试验
• 5.9 小结
• 6 讨论及展望
• 6.1 本课题结论及创新意义
• 6.2 讨论
• 6.2.1 关于装置
• 6.2.2 关于维生素E
• 6.2.3 关于2，3-DPG
• 6.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读硕士学位期间的相关科研及论文情况