人泛素基因原核表达载体的构建、表达及鉴定

论文摘要

泛素（Ubiquitin,Ub）是一个由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链。它在细胞中以非共价键方式或通过共价键与蛋白质牢固结合。主要功能是参与蛋白质降解,通过介导蛋白降解、改变蛋白的细胞定位、改变蛋白的酶活性、改变蛋白与蛋白的相互作用等方式影响其所结合蛋白的功能与活性。而蛋白质降解异常又与许多疾病的发生密切相关。随着医学分子生物学技术的进步,人们已经从分子机制上认识和讨论它们之间的关系。近年来泛素及其类似物已经成为了分子生物学的研究热点之一。本试验根据GenBank中已发表的人泛素基因mRNA序列,借助Primer5.0设计了六对寡核苷酸引物,运用引物搭桥法合成目的序列Ub。在克隆出人泛素基因（Ub）的基础上,构建原核表达载体pGEX-4T-Ub并对Ub基因进行了原核表达和纯化,为进一步研究其功能奠定了基础。研究结果如下:1.根据GenBank（登陆号:M17524）中公布的人泛素基因（Ub）序列设计特异性引物,用引物搭桥法进行PCR扩增,获得228bp的DNA片段。2.利用定向克隆的方法,以pGEX-4T-1为载体,利用BamH I和SalⅠ酶切位点,将纯化的基因Ub克隆至pGEX-4T-1中,构建了原核表达载体pGEX-4T-Ub。经酶切鉴定筛选出阳性克隆,进一步的序列分析确认了其中Ub序列的正确性。3.将原核表达质粒pGEX-4T-Ub,转化至E.coli BL21（DE3）pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导后SDS-PAGE分析,在约35 kD处出现了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带。4. Western blot分析重组蛋白,在目的蛋白相应位置出现了特异性的染色条带,这表明所表达的重组蛋白是人泛素蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 泛素基因的研究进展
• 1.1 泛素的概念
• 1.2 泛素的研究历史
• 1.3 泛素的类型
• 1.4 泛素的主要生物学功能
• 1.5 泛素样小修饰物的分子生物学研究
• 1.6 应用与展望
• 1.7 本实验的研究目的与意义
• 第二章 实验材料
• 2.1 质粒和菌株
• 2.2 常用培养基和溶液及试剂的配制
• 2.3 酶和生化试剂
• 2.4 引物
• 2.5 主要仪器和设备
• 第三章 实验方法
• 3.1 人泛素基因的合成、克隆及序列分析
• 3.1.1 目的基因的合成
• 3.1.2 人泛素基因原核表达载体的构建
• 3.1.3 大肠杆菌超级感受态细胞的制备
• 3.1.4 重组克隆载体的转化
• 3.1.5 阳性克隆的筛选
• 3.1.6 阳性重组质粒的筛选
• 3.1.7 抽提阳性重组质粒
• 3.1.8 DNA 序列分析
• 3.2 目的基因在大肠杆菌中表达的初步研究
• 3.2.1 E.coli BL21（DE3）超级感受态菌的制备
• 3.2.2 表达重组质粒转化表达宿主菌E.coli BL21（DE3）
• 3.2.3 诱导温度对目的蛋白表达的影响
• 3.2.4 诱导剂IPTG 浓度对目的蛋白表达的影响
• 3.2.5 诱导时间对目的蛋白表达的影响
• 3.3 蛋白的提取和纯化及鉴定
• 3.3.1 菌体的收集
• 3.3.2 菌体的裂解
• 3.3.3 目的蛋白纯化-亲和层析
• 3.3.4 目的蛋白的SDS-PAGE 鉴定
• 3.3.5 目的蛋白的Western blot 鉴定
• 第四章 实验结果
• 4.1 PCR 扩增产物
• 4.2 目的基因PCR 产物的纯化
• 4.3 重组克隆质粒的鉴定
• 4.4 DNA 测序结果
• 4.5 诱导温度对目的蛋白表达的影响
• 4.6 诱导剂IPTG 浓度对目的蛋白表达的影响
• 4.7 诱导时间对目的蛋白表达的影响
• 4.8 目的蛋白的表达纯化及鉴定
• 第五章 讨论
• 5.1 立题依据
• 5.2 目的基因的设计和载体的选择
• 5.3 目的蛋白表达及纯化
• 5.4 目的蛋白检测结果分析
• 参考文献
• 附录1
• 附录 2
• 致谢
• 个人简历