产纤维素酶海洋普鲁兰类酵母的初步研究及CMCase的纯化与性质研究

论文摘要

从实验室海洋酵母菌种库的300余株海洋酵母菌中通过刚果红筛选平板初筛选得到19株能产纤维素酶的海洋酵母菌,经过复筛得到一株纤维素酶活力相对较高的菌株98,该菌株分离自中国青岛东风盐场表层海水。通过传统的酵母菌种鉴定及分子生物学鉴定,最终鉴定该株海洋酵母菌属于普鲁兰类酵母（Aureobasidium pullulans）。对其发酵产酶培养基进行了优化,其最适产酶培养基组成为（w/v）:2.0%可溶性淀粉,0.5%蛋白胨,2.0%酵母粉,海水配制,起始pH值调至7.0。在28℃,160r/min振荡培养24h后,产葡聚糖内切酶（CMCase）活达到4.51U/mg,滤纸酶活达到4.75U/mg。并对粗酶液的水解产物进行了薄层层析研究,发现纤维素酶水解羧甲基纤维素钠（CMC）和滤纸的酶解产物大部分是单糖,另外有少量的二糖。这是首次关于海洋酵母菌能够产生纤维素酶的报道。通过SephradexTM G-75凝胶过滤层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析方法对海洋普鲁兰类酵母菌株98所产葡聚糖内切酶（CMCase）进行了纯化,最终得到一个纯的葡聚糖内切酶组分,SDS-PAGE检测该葡聚糖内切酶（CMCase）分子量大约为67kDa,组分单一,最终纯酶与原样品相比,纯化倍数1.98倍,回收率15.3%。该纯化的CMCase大小与已知有些纯化的黑曲霉的纤维素酶（CMCase）的分子量相仿。对纯化的CMCase进行了性质研究,发现纯化的CMCase在40°C时酶活最高,在温度低于30°C时是稳定的,当温度高于45°C时,酶活迅速降低。此CMCase在pH5.6时酶活达到最高,在pH5.0到pH6.0时酶活相对较为稳定,只有pH低于5.0或高于6.0时酶活明显的降低。金属离子对纯化的CMCase酶活的影响,其中Na+、Mg2+、Ca2+、K+、Fe2+、Cu2+对酶活有激活作用,而当存在Fe3+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Ag时,CMCase活性受到抑制,特别是Ba2+存在时酶活明显降低。蛋白抑制剂（PMSF、SDS、EDTA、EGTA、DTT、碘乙酸）对纯化的CMCase的活性均有抑制作用,其中SDS对纤维素酶CMCase活性影响最大,纯化的CMCase对底物CMC的Km值和Vmax分别是4.73 mg/mL和0.566μmol/min/mg蛋白,并利用纯化的CMCase（葡聚糖内切酶）水解羧甲基纤维素钠（CMC）,对水解液进行薄层层析分析,显示纯化的CMCase具有β-1,4-葡聚糖内切酶活性,能够随机水解CMC内部的β-1,4-糖苷键,水解产生除单糖之外的低聚寡糖,说明该纯化的酶确实为β-1,4-葡聚糖内切酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 纤维素的组成和结构
• 1.2 纤维素酶的组成
• 1.3 纤维素酶（系）主要的性质
• 1.4 纤维素酶的作用机理
• 1.5 产纤维素酶的微生物
• 1.6 纤维素酶的应用
• 1.6.1 在发酵工业中的应用
• 1.6.2 在洗涤剂工业中的应用
• 1.6.3 在纺织工业上的应用
• 1.6.4 在畜牧中的应用
• 1.6.5 在食品工业中的应用
• 1.6.6 纤维素酶在能源工业中的应用
• 1.6.7 在中草药有效成分提取中的应用
• 1.6.8 在植物遗传工程中的应用
• 1.6.9 在地质钻井中的应用
• 1.6.10 在废纸脱墨中的应用
• 1.7 酶分离纯化
• 1.7.1 根据蛋白分子大小所采用的蛋白分离方法
• 1.7.2 根据蛋白溶解度不同所采用的蛋白分离方法
• 1.7.3 根据蛋白电荷性质差异所采用的蛋白分离方法
• 1.7.4 根据蛋白疏水特性分离纯化蛋白
• 1.8 论文的研究目的与意义
• 第二章 产纤维素酶海洋酵母菌的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 培养条件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 产纤维素酶海洋酵母菌株的初筛
• 2.2.2 产纤维素酶海洋酵母菌株的复筛
• 2.2.3 纤维素酶比活力的测定
• 2.3 产纤维素酶海洋酵母菌株的初筛及复筛结果
• 2.4 本章小结
• 2.5 讨论
• 第三章 产纤维素酶海洋酵母菌菌株98 的鉴定
• 3.1 常规鉴定
• 3.1.1 培养基
• 3.1.2 鉴定方法及步骤
• 3.2 分子鉴定
• 3.2.1 菌株及质粒
• 3.2.2 实验方法及操作
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 常规鉴定结果
• 3.3.2 分子方法鉴定结果
• 3.4 本章小结
• 3.5 讨论
• 第四章 海洋普鲁兰类酵母A. pullulans 98 产纤维素酶发酵条件优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 培养基和菌株
• 4.1.2 培养条件
• 4.1.3 细胞生长量的测定
• 4.1.4 纤维素酶活力测定
• 4.1.5 温度和pH 对纤维素酶活力影响的测定
• 4.1.6 发酵条件的优化
• 4.1.7 薄层层析分析（TLC）
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 温度和 pH 对海洋酵母菌菌株 98 产纤维素酶活力的影响
• 4.2.2 发酵条件的优化结果
• 4.2.3 薄层层析结果
• 4.3 本章小结
• 第五章 海洋普鲁兰类酵母A. pullulans 98 液体发酵生产 CMCase 的分离纯化和特性研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基和试剂
• 5.1.3 方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 纤维素酶发酵液浓缩及SephradexTM G-75 凝胶层析部分纯化
• 5.2.2 DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换层析柱纯化
• 5.2.3 CMCase 纯化过程参数和不连续SDS-PAGE 凝胶电泳
• 5.2.4 纯化的CMCase 最适温度和对温度的稳定性
• 5.2.5 纯化的CMCase 最适pH 和对pH 的稳定性
• 5.2.6 金属离子对纯化的CMCase 酶活的影响
• 5.2.7 蛋白抑制剂对纯化的CMCase 酶活的影响
• 5.2.8 动力学常数Km 和最大反应速度Vmax 的测定
• 5.2.9 纯化的 CMCase 薄层层析 （TLC） 分析结果
• 5.3 本章小结
• 总结与创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士期间发表的学术论文