论文摘要
第一部分高铁和低铁环境对成骨细胞生物活性影响的比较研究目的观察成骨细胞（hFOB1.19）在高铁环境、低铁环境培养后，细胞生物活性指标的变化趋势，比较两种培养环境对成骨细胞生物学活性的影响。方法成骨细胞（hFOB1.19）常规培养，培养基分别加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度枸橼酸铁铵（FAC）构成高铁培养环境；同样，分别加入5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L去铁胺（DFO）构成低铁培养环境。各组培养不同时间后，检测成骨细胞生物活性指标：细胞内的铁离子、细胞增殖活性、碱性磷酸酶活性、细胞凋亡、钙结节染色、Ⅰ型胶原（COL1）和骨钙素（OC）的基因及蛋白表达。对照组加入去离子水。结果在FAC组，随FAC的浓度增加，细胞内的铁离子逐渐增加，成骨细胞增殖、分化、矿化、Ⅰ型胶原（COL1）和骨钙素（OC）的基因和蛋白表达指标呈剂量依赖性减低；在DFO组，随DFO的浓度增加，细胞内的铁离子逐渐减少，小剂量的DFO可促进成骨细胞上述生物活性指标，大剂量的DFO则抑制上述指标。结论高铁培养环境对成骨细胞生物活性具有抑制作用，呈剂量依赖性，低铁培养环境对成骨细胞生物活性存在双重剂量效应：适当的低铁环境对成骨细胞生物活性具有促进作用，但严重的低铁环境对成骨细胞生物活性也具有一定的抑制作用。一定范围的铁浓度可使成骨细胞生物活性达到最佳状态。第二部分高铁环境对成骨细胞生物活性影响的相关机制研究目的研究高铁环境对成骨细胞生物活性作用的相关机制。方法34℃条件下体外培养人成骨细胞（hFOB1.19），以不同浓度（50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）枸橼酸铁铵（FAC）干预，用RT-PCR检测成骨细胞铁调节基因膜转铁蛋白1（FPN1）、转铁蛋白受体（TfR）和二价金属转运蛋白1（DMT1）的表达变化；流式细胞仪检测成骨细胞活性氧（ROS）水平；丙二醛（Maleic Dialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-PX）试剂盒检测成骨细胞MDA含量及SOD、GSH-PX活性；为进一步明确氧化应激在其中的意义，同时用2.5mmol/L抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预，再次用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧（ROS）的水平，CCK-8法检测各组细胞活力，RT-PCR法检测各组细胞OPG、OC和COL1mRNA表达的变化，碱性磷酸酶活性试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶活性。结果FAC干预后，FPN1mRNA的表达随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性上调，TfR、DMT1mRNA的表达呈剂量依赖性下调（P<0.05）；成骨细胞ROS水平随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性升高（P<0.05）；成骨细胞脂质过氧化物MDA水平呈剂量依赖性升高，成骨细胞抗氧化物酶SOD及GSH-PX活性呈剂量依赖性降低（P<0.05）；进一步加入NAC后分组观察，不同干预组成骨细胞内活性氧含量差异显著不同（P<0.05），FAC组显著高于对照组，FAC+NAC组低于FAC组、高于NAC组；各组间活性氧含量的变化与成骨细胞活力、OPG、OC和COL1mRNA表达、碱性磷酸酶活性呈负相关性，组间比较有统计学差异（P<0.05）。结论铁过载对成骨细胞生物活性有明显抑制作用，其机制可能与细胞内铁离子浓度增加后导致的氧化应激损伤有关。第三部分高铁环境对成骨细胞和破骨细胞分化的影响目的了解高铁培养环境对成骨细胞和破骨细胞分化的影响。方法37℃条件下体外培养以小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1，在10mmol/l β-甘油磷酸和50μg/ml抗坏血酸的诱导分化的作用下，分化为成骨细胞，同时用不同浓度（50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l）枸橼酸铁铵（FAC）干预，用RT-PCR检测成骨细胞分化基因成骨相关转录因子（Runx2）、锌指结构转录因子（Osterrix）、骨唾液酸蛋白（BSP）和骨钙素（OC）的表达，碱性磷酸酶活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性；37℃条件下体外培养以小鼠单核细胞RAW264.7，在20ng/ml核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的诱导分化的作用下，分化为破骨细胞，同时用不同浓度（12μmol/L、25μmol/L、50μmol/L）枸橼酸铁铵（FAC）干预，CCK-8法检测细胞活力，抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）观察TRAP阳性细胞形成情况并计数，RT-PCR检测破骨细胞分化基因抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、组织蛋白酶K（CTK）和金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达。结果成骨细胞分化相关基因的表达随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性下调（P<0.05），成骨细胞ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低（P<0.05）。TRAP阳性细胞的数量随FAC干预浓度的增加而增加（P<0.05），破骨细胞分化相关基因的表达随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性上调（P<0.05）。结论高铁培养环境明显抑制小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1向成骨细胞分化，明显促进小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化。第四部分铁过载对去势大鼠骨代谢的影响目的观察高铁干预后去势大鼠体内铁代谢与骨代谢的变化，探讨铁过载对去势大鼠骨代谢的影响。方法将32只3月龄雌性SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、去势组（OVX）、OVX+FAC低剂量组（FAC1）、OVX+FAC中剂量组（FAC2）和OVX+FAC高剂量组（FAC3）。去势后1周，FAC1、 FAC2和FAC3组分别按45、90、180mg/kg腹腔注射，每周2次，OVX组和Sham组按同样方式和频次给予等量生理盐水。干预9周后处死取材，生化法测血清铁离子含量，电感耦合等离子体发射光谱仪ICP法测定大鼠左侧胫骨铁含量, Perl’s法对肝脏切片进行铁染色观察, Micro-CT对股骨远端进行三维图像分析，骨组织切片行HE染色观察，酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清β-Ⅰ型胶原羧基端肽（β-CTX）和骨钙素（BGP）的含量。结果与Sham组比较，OVX组血清铁和胫骨铁含量明显降低（P<0.05）；与OVX组比较，FAC1组、FAC2组和FAC3组血清和胫骨铁随FAC干预浓度的增加明显升高，组间比较有统计学差异（P<0.05）；FAC1组、FAC2组和FAC3组肝脏染色明显可见蓝染铁颗粒；Micro-CT结果显示，与Sham组相比，OVX组骨小梁变疏松，FAC1组、FAC2组和FAC3组随FAC干预浓度的增加骨小梁更加疏松、连续性下降，空隙率增加；骨组织病理切片染色显示Sham组大鼠骨小梁饱满，形态结果完整，排列紧密有序成网状；OVX组骨小梁较为稀疏，小梁间隙增大；FAC1组、FAC2组和FAC3组随FAC干预浓度的增加骨小梁更加稀疏，变细、变薄，有扭曲或断裂；ELISA结果显示，与Sham组比较，OVX组、FAC1组、FAC2组和FAC3组BGP和CTX的水平均明显升高（P<0.05），但BGP的水平在后四组组间相比无明显差异（P>0.05），但β-CTX的水平在后四组随FAC干预浓度的增加明显升高，组间比较有统计学差异（P<0.05）。结论铁过载可加重去势大鼠的骨质疏松，其机制可能与铁过载促进骨吸收有关。