论文题目: 唐古特山莨菪毛状根托品烷类生物碱生物合成相关基因的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生药学
作者: 刘涛
导师: 程克棣
关键词: 唐古特山莨菪,毛状根,茄科,莨菪碱羟基化酶,腐胺甲基转移酶,托品酮还原酶,克隆,表达,纯化,功能分析
文献来源: 中国协和医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 唐古特山莨菪是特产于青藏高原的中草药，该植物形成东莨菪碱的能力较强，是生产山莨菪碱和东莨菪碱的重要资源植物。 本文对唐古特山莨菪中托品烷类生物碱生物合成过程中的相关酶基因进行了克隆、表达及功能分析，并对体外和体内的生物转化进行了研究。 唐古特山莨菪毛状根莨菪碱6β-羟基化酶的克隆、表达及功能分析 莨菪碱6β-羟基化酶是托品烷类生物碱生物合成过程中的关键酶，催化莨菪碱通过山莨菪碱形成东莨菪碱。对唐古特山莨菪毛状根总RNA进行RT-PCR得到了一段编码AtH6H基因的片段。通过RACE获得了AtH6H cDNA全长序列，其长度为1305 bp，含有5′-UTR，3′-UTR，poly(A)~+结构以及一个1035 bp的开放阅读框架，编码344个氨基酸残基。将该序列提交GenBank注册，编号为AY356396。 将AtH6H构建表达载体并在大肠杆菌中表达，并对目的表达产物进行镍离子亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow层析后，得到了纯化的AtH6H酶蛋白。对酶催化产物进行TLC、HPLC和NMR分析，并对酶的性质进行了研究。结果显示，AtH6H是一个双功能酶，既具有羟基化酶的活性，又具有环氧化酶的活性，可以将莨菪碱通过山莨菪碱转化为东莨菪碱。 本文研究了表达AtH6H的大肠杆菌对底物的体内转化。表达AtH6H的大肠杆菌可以体内转化莨菪碱形成山莨菪碱和东莨菪碱，也可以转化山莨菪碱形成东莨菪碱。 将AtH6H构建表达载体于毕赤酵母中表达，但没有检测到酶活力。 唐古特山莨菪毛状根腐胺N-甲基转移酶的克隆、表达及功能分析 腐胺N-甲基转移酶是托品烷类生物碱生物合成过程中的第一个酶，催化腐胺形成N-甲基腐胺。对唐古特山莨菪毛状根总RNA进行RT-PCR得到了一段编码AtPMT基因的序列。通过RACE获得了AtPMT cDNA全长序列，其长度为1303 bp，含有5′-UTR，3′-UTR，poly(A)~+结构以及一个1017 bp的开放阅读框架，编码338个氨基酸残基。将该序列提交GenBank注册，编号为AY690623。 将AtPMT构建表达载体并在大肠杆菌中进行表达，并对目的表达产物进行镍离子
论文目录:
摘要
ABSTRACT
符号缩写说明
第一章 绪论
1.1 托品烷类生物碱的概况
1.2 托品烷类生物碱的生物合成途径
1.3 托品烷类生物碱代谢工程的研究进展
1.4 唐古特山莨菪的相关资料
1.4.1 唐古特山莨菪的生药
1.4.2 唐古特山莨菪的研究进展
1.5 本工作的目标及拟解决的问题
第二章 唐古特山莨菪毛状根莨菪碱6β-羟基化酶的克隆、表达及功能分析
2.0 引言
2.1 实验材料与设备
2.1.1 材料
2.1.2 设备
2.2 方法
2.2.1 AtH6H的克隆
2.2.1.1 总RNA的分离纯化
2.2.1.2 RT-PCR
2.2.1.3 RACE
2.2.1.3.1 3′-RACE
2.2.1.3.2 5′-RACE
2.2.1.4 ORF的获得
2.2.2 AtH6H在E.coli中的表达
2.2.2.1 表达载体的构建
2.2.2.2 AtH6H在E.coli中的表达
2.2.3 AtH6H的纯化
2.2.3.1 HiTrap Chelating HP柱层析
2.2.3.2 DEAE Sepharose Fast Flow柱层析
2.2.4 AtH6H的功能研究
2.2.4.1 AtH6H催化反应体系
2.2.4.2 AtH6H催化产物的检测与鉴定
2.2.4.3 AtH6H的性质
2.2.5 重组E.coli对托品烷类生物碱的生物转化
2.2.5 AtH6H在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
2.2.5.1 表达载体的构建
2.2.5.2 质粒的线性化
2.2.5.3 感受态细胞的制备及电转化
2.2.5.4 酵母表达
2.2.6 AtH6H的基因组拷贝数分析
2.2.6.1 植物基因组DNA的提取
2.2.6.2 Southern blotting
2.3 结果与讨论
2.3.1 AtH6H的克隆
2.3.1.1 总RNA的提取
2.3.1.2 RT-PCR产物序列分析
2.3.1.3 RACE
2.3.2 AtH6H在E.coli中的表达纯化及性质研究
2.3.2.1 表达载体的构建
2.3.2.2 AtH6H在E.coli中的表达
2.3.2.3 AtH6H的纯化
2.3.2.4 AtH6H的性质
2.3.2.4.1 酶催化产物的鉴定
2.3.2.4.2 酶的特性
2.3.2.5 突变体的小发现
2.3.3 重组E.coli对托品烷类生物碱的生物转化
2.3.4 AtH6H在毕赤酵母中的表达
2.3.4.1 表达载体的构建
2.3.4.2 表达预试验
2.3.5 AtH6H基因组分析
2.4 本章小结
第三章 唐古特山莨菪毛状根腐胺 N-甲基转移酶的克隆、表达及功能分析
3.0 引言
3.1 实验材料与设备
3.1.1 材料
3.1.2 设备
3.2 方法
3.2.1 AtPMT的克隆
3.2.1.1 总RNA的分离纯化
3.2.1.2 RT-PCR
3.2.1.3 RACE
3.2.1.3.1 3′-RACE
3.2.1.3.2 5′-RACE
3.2.1.4 ORF的获得
3.2.2 AtPMT在E.coli中的表达
3.2.2.1 表达载体的构建
3.2.2.2 AtPMT在E.coli中的表达
3.2.3 AtPMT的纯化
3.2.3.1 HiTrap Chelating HP柱层析
3.2.3.2 DEAE Sepharose Fast Flow柱层析
3.2.4 AtPMT的功能研究
3.2.4.1 AtPMT催化反应体系
3.2.4.2 催化产物的检测与鉴定
3.2.4.3 AtPMT的性质
3.2.5 重组E.coli对腐胺的生物转化
3.3 结果与讨论
3.3.1 AtPMT的克隆
3.3.1.1 RT-PCR产物序列分析
3.3.1.2 RACE
3.3.2 AtPMT在E.coli中的表达纯化及性质研究
3.3.2.1 表达载体的构建
3.3.2.2 AtPMT在E.coli中的表达
3.3.2.3 AtPMT的纯化
3.3.2.4 AtPMT的性质
3.3.2.4.1 催化产物的鉴定
3.3.2.4.2 酶的特性
3.3.3 重组E.coli对腐胺的生物转化
3.4 本章小结
第四章 唐古特山莨菪毛状根托品酮还原酶的克隆
4.0 引言
4.1 实验材料与设备
4.1.1 材料
4.1.2 设备
4.2 方法
4.2.1 AtTR的克隆
4.2.1.1 总RNA的分离纯化
4.2.1.2 RT-PCR
4.2.1.3 RACE
4.2.1.3.1 3′-RACE
4.2.1.3.2 5′-RACE
4.3 结果与讨论
4.3.1 AtTR的克隆
4.3.1.1 RT-PCR产物序列分析
4.3.1.2 RACE
4.4 本章小结
总结
综述1：α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的生化和分子生物学研究进展
综述2：植物中生物碱的生化和分子生物学研究进展
参考文献
博士在读期间发表的学术论文
致谢
原创性及知识产权声明
发布时间: 2006-10-13
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