论文摘要
目的:通过脂质体把Omi/HtrA2短发夹RNA（shRNA）表达质粒转染入大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,用G418筛选出阳性单克隆细胞。应用RNA干扰（RNAi）技术抑制Omi/HtrA2蛋白的表达,探讨Omi/HtrA2 shRNAs在缺氧/复氧诱导NRK-52E凋亡中的作用及其机制。方法:实验分为5组:正常组（常规培养组）,模型组（缺氧/复氧组）,HK组（转染重组质粒Pgenesil-1/HK组）,shRNA1组（转染Pgenesil-1/Omi/HtrA2 shRNA1组）,shRNA2组（转染Pgenesil-1/Omi/HtrA2 shRNA2组）,每组6瓶（75ml培养瓶）细胞。把NRK-52E接种到6孔板中,细胞融合度达到50%-60%时,用脂质体siPORT XP-1对重组质粒进行转染（脂质体/重组质粒为:3/1,μl/μg）。8h后换用无抗生素的10%胎牛培养基,24h后用含G418（300μg/ml）培养基进行筛选。约2周后获得抗性稳定的单克隆细胞并扩大培养（G418150μg/ml维持）。在荧光显微镜下观察转染效率。除正常组外,其他四组用无氧液代替培养基,然后充入配好的缺氧气体（含体积分数为95%的N2和5%的CO2）,迅速封闭瓶口,37℃缺氧45min,常规条件下复氧90min后收集细胞。用胞浆蛋白提取试剂盒进行胞浆蛋白的提取,提取后的蛋白-70℃保存。用western blot检测各组Omi/HtrA2、caspase-3/-9蛋白表达,用比色法测定各组caspase-3/-9的活性。结果:转染24h后在倒置荧光显微镜下可以观察荧光蛋白表达较明显,转染组细胞均可见绿色荧光。用photoshop软件对western blot结果进行分析显示:与模型组相比,shRNA1组和shRNA2组Omi/HtrA2、caspase-3/-9蛋白表达明显减少（P＜0.01）。模型组和HK组、shRNA1组和shRNA2组之间Omi/HtrA2、caspase-3/-9蛋白表达差别不明显。与正常组相比,模型组Omi/HtrA2、caspase-3/-9蛋白表达明显增加（P＜0.01）;各组caspase-3/-9的活性与western blot检测结果相一致。结论:短发夹RNA Pgenesil-1/Omi/HtrA2 shRNA1和Pgenesil-1/Omi/HtrA2 shRNA2能明显抑制缺氧/复氧诱导的NRK-52E中Omi/HtrA2蛋白的表达,从而抑制procaspase-9的活化,进而减少了下游procaspase-3的激活,最终减轻了缺氧/复氧诱导的NRK-52E凋亡的程度。