高密度培养裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸

论文摘要

二十二碳六烯酸（DHA）是一种极其重要的ω-3系列高度不饱和脂肪酸,具有促进婴幼儿大脑发育、保护视力、预防心血管疾病以及提高机体免疫能力等重要生理功能。因此,DHA已广泛用于生产婴幼儿食品、保健食品和辅助治疗剂等产品,其制备和加工方法也日受关注。商业鱼油因鱼类资源供应限制,DHA含量较低,有鱼腥味等诸多不利因素,难以满足市场需求。因此,开发安全、可靠的DHA新来源已成为当前研究的热点。裂殖壶菌Schizochytrium sp.是一种海洋真菌,该菌DHA含量高、生长快、易于培养、对人畜无毒害,是一种极具工业化生产前景的DHA微生物资源。本论文主要研究了如何实现裂殖壶菌的高密度培养的相关工艺和过程。首先,对DHA提取方法进行研究,确定了125℃干燥3 h的高温干燥方法为较优的破胞方法,该法既保证充分破胞,又有利于DHA的提取。通过各种脂质提取方法的比较,得出一种新的脂质提取方法一酸性正己烷法,即菌体经过高温干燥后,先用盐酸水解,再用正己烷萃取,该方法实现了脂质的充分、高效提取。其次,通过5 L德国贝朗发酵罐对裂殖壶菌进行培养,优化pH、溶氧等发酵条件,确定了较优的间歇培养发酵条件:温度25℃,pH 5.5,溶氧水平30%,通气量4 L/min。此条件下,最终的生物量、脂肪酸和DHA含量分别为36.7 g/L、23.8g/L和5.4 g/L,比优化前分别提高了10.0%,16.7%和38.6%,DHA平均产率rDHA为56.8 mg/（h.L）。然后,根据裂殖壶菌间歇发酵的特性,通过对恒速流加全浓缩培养基和葡萄糖（600 g/L）与变速流加葡萄糖（600 g/L）两种流加方式的考察,得出维持葡萄糖浓度在10-20 g/L之间的变速流加方式,对裂殖壶菌的生长和脂肪酸的积累较有利,培养5天后,其生物量、脂肪酸以及DHA含量分别为60.6 g/L、40.2 g/L和8.0 g/L,rDHA为66.7 mg/（h.L）。在此基础上,通过30 L发酵罐的放大培养,其生物量达到55.5 g/L,发酵液经过膜过滤、喷雾干燥后得到DHA菌粉,其DHA含量为13.5 g/100 g菌粉。最后,以报道的半合成培养基为基础对裂殖壶菌进行流加培养,并考察维生素和微量元素的添加对裂殖壶菌生长和DHA产量的影响,进一步优化原来的发酵培养基。以优化的培养基为基础进一步确定流加培养方案,即通过在对数生长期前期（24 h）流加碳氮比为36:1的营养液,在对数期后期（84 h）流加高浓度葡萄糖（600 g/L）,发酵120 h后,其生物量达到73.0 g/L,DHA产量为9.8 g/L,比优化前的间歇发酵分别提高了1.2倍和1.5倍,而rDHA为81.9 mg/（L.h）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 DHA简介及生理功能
• 1.1.1 DHA的结构和性质
• 1.1.2 DHA的生理功能
• 1.2 DHA的应用与市场行情
• 1.2.1 DHA的应用
• 1.2.2 DHA的市场行情
• 1.3 DHA的来源
• 1.3.1 DHA目前的主要商业来源
• 1.3.2 DHA的可替代来源
• 1.4 微生物中DHA的合成途径
• 1.4.1 DHA的FAS合成途径
• 1.4.2 DHA的PKS合成路径
• 1.5 真菌发酵生产 DHA的研究进展
• 1.5.1 生产菌株
• 1.5.2 真菌发酵生产 DHA
• 1.5.3 DHA生产菌发酵工艺条件的优化研究
• 1.6 选题意义及研究内容
• 1.6.1 选题意义
• 1.6.2 本课题的研究内容
• 第二章 裂殖壶菌破碎、脂质提取条件优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.2 实验设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 菌种保藏
• 2.3.2 培养方法
• 2.3.3 菌体破胞方法
• 2.3.4 脂肪酸提取方法
• 2.3.5 DHA的检测方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 裂殖壶菌的脂肪酸组成
• 2.4.2 菌体破胞方法的确定
• 2.4.3 脂质提取方法的确定
• 2.5 本章小结
• 第三章 裂殖壶菌5L发酵罐间歇发酵条件的优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.2 实验设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌种保藏
• 3.3.2 培养方法
• 3.4 分析方法
• 3.4.1 葡萄糖浓度的测定
• 3.4.2 细胞干重的测定
• 3.4.3 脂肪酸的测定
• 3.4.4 DHA含量的测定
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 5L发酵罐培养裂殖壶菌的生长曲线
• 3.5.2 裂殖壶菌的培养条件优化
• 3.6 本章小结
• 第四章 在 5L和30 L发酵罐上裂殖壶菌的高密度流加培养
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.2 实验设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 菌种保藏
• 4.3.2 培养方法
• 4.4 分析方法
• 4.4.1 葡萄糖浓度的测定
• 4.4.2 细胞干重的测定
• 4.4.3 脂质量的测定
• 4.4.4 DHA含量的测定
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 恒速流加全培养基
• 4.5.2 恒速流加葡萄糖
• 4.5.3 变速流加葡萄糖
• 4.5.4 三种流加方式的比较
• 4.5.5 30 L发酵罐的放大培养
• 4.6 本章小结
• 第五章 裂殖壶菌高密度培养流加方案的进一步优化
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 实验试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.2 实验设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 菌种保藏
• 5.3.2 培养方法
• 5.4 分析方法
• 5.4.1 葡萄糖浓度的测定
• 5.4.2 细胞干重的测定
• 5.4.3 脂质量的测定
• 5.4.4 DHA含量的测定
• 5.5 结果与讨论
• 5.5.1 以半合成培养基为基础的流加培养
• 5.5.2 以RM培养基为基础进一步优化 FM培养基
• 5.5.3 以优化的发酵培养基为基础进一步确定流加培养方案
• 5.6 本章小结
• 第六章 结论及展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢