抗蛋白酶激活受体-4单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

背景与目的:Kahn和Xu于1998年成功克隆了PAR4基因[1],并从淋巴瘤Daudi细胞中得到了它的序列,全长为4.9kb。其由385个氨基酸组成,和其它3种PARs有33%的同源性,细胞外包含一个推定的Arg/Gly丝氨酸蛋白酶切割位点, Northern blot显示PAR4的mRNA表达于人类的很多组织:肺脏上高表达,胰脏,甲状腺,睾丸及小肠亦表达;荧光原位杂交实验显示人的PAR4基因位于19p12染色体。但是PAR4在炎症及其他疾病中的确切作用及其机制还需要进一步的研究,因此我们制备廉价、有效的抗PAR-4 mAb具有重要意义。方法:以受Fmoc树脂保护PAR-4特异性合成多肽（13肽）为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选可特异性分泌抗PAR-4 mAb的杂交瘤细胞;采用capture ELISA法鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、Dot blot、免疫组织化学染色法、流式细胞分析、激光共聚焦扫描显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果:结果:获得3株可稳定分泌抗PAR4 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb均为IgM;免疫组化染色表明,mAb将人结肠组织中的腺上皮细胞、疑似肥大细胞和淋巴细胞,扁桃体中的淋巴细胞和包皮组织中的肥大细胞染成褐色;流式细胞术分析显示,3株mAb与A549细胞的PAR4均呈阳性反应;激光共聚焦扫描显微镜观察,荧光标记的阳性反应物主要位于A549细胞的胞浆和胞膜上。结论:成功地制备抗PAR4 mAb,为血液疾病、变态反应性疾病和炎症性疾病的研究工作提供了有用的试剂。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第1章 前言
• 1.1 抗体
• 1.2 单克隆抗体
• 1.2.1 单克隆抗体的概念
• 1.2.2 单克隆抗体的作用机制
• 1.2.3 单克隆抗体的应用
• 1.2.4 单克隆抗体的重大意义
• 1.3 蛋白酶活化受体-4 （PAR4）
• 1.3.1 蛋白酶活化受体的结构和激活特点
• 1.3.2 PAR4 的生物学性质
• 1.3.3 PAR4 介导的信号转导
• 1.3.4 PAR4 与凝血异常疾病的关系
• 1.3.5 PAR4 与炎症
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要材料和试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 实验液体配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 间接ELISA检测抗体
• 2.2.2 PAR4 mAb杂交瘤细胞的建立
• 2.2.3 PAR4 mAb效价及Ig的鉴定亚类
• 2.2.4 PAR4 mAb 应用
• 2.2.5 PAR4 mAb的体外扩大培养及上清收集
• 2.2.6 PAR4 mAb的粗提
• 第3章 实验结果
• 3.1 PAR4mAb杂交瘤细胞的建立
• 3.2 PAR4 mAb效价及Ig亚类的鉴定
• 3.2.1 PAR4 mAb效价测定
• 3.2.2 PAR4 mAb Ig亚类的鉴定
• 3.3 PAR4 mAb应用
• 3.3.1 Dot blot
• 3.3.2 免疫组织化学染色
• 3.3.3 PAR4 mAb 流式细胞术
• 3.3.4 PAR4 mAb激光共聚焦显微镜
• 3.4 PAR4 mAb的体外扩大培养及上清收集
• 3.5 PAR4 mAb的粗提
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 第6章 参考文献
• 附录
• 附图
• 致谢
• 在学期间发表论文
• 本人简历