养殖牙鲆肿瘤抑制基因p53的克隆及与淋巴囊肿病关系的研究

论文摘要

p53基因是一种重要的肿瘤抑制基因,目前已克隆得到了多种鱼类的p53基因序列,但牙鲆体内的该基因未见报道。本文采用RACE技术克隆了牙鲆的cDNA全长,表明该基因cDNA全长1798bp,包括238bp的5’非编码区（UTR）、1095开放阅读框（ORF）、TGA终止密码子和432bp的3’非编码区（UTR）。该p53基因编码365个氨基酸,分子量约为40.9 Kda,等电点为6.5。序列分析表明:牙鲆p53蛋白和青鳉、川鲽的p53蛋白同源性较高,而与人、斑马鱼、鸡、爪蟾、虹鳟的p53蛋白同源性较低。p53基因在鱼类中分化程度较高,但本研究显示牙鲆p53蛋白在结构和序列上拥有p53蛋白的典型特征,如具有5个进化上高度保守的氨基酸簇、酸性疏水的N-末端,亲水带电的C-末端和倒数第二位上可以磷酸化的丝氨酸残基。本文采用RT-PCR法检测了p53基因的组织表达,研究表明:p53基因在健康牙鲆被检组织内均有表达,患淋巴囊肿病的牙鲆p53基因组织表达特征同健康牙鲆相似。本文利用PCR方法克隆了牙鲆p53基因DNA序列,结果显示:该基因全长5208bp,由11个外显子和10个内含子组成,第一个外显子不编码氨基酸序列, p53蛋白5个高度保守区域由第2、4、5、7和8外显子编码。本文克隆获得的牙鲆p53基因与人、鼠、斑马鱼和青鳉等的p53基因在结构上相同,表明p53基因的结构在进化上保守性较强。在获得牙鲆p53基因DNA序列的基础上,本文利用PCR-RFLP方法检测了牙鲆p53基因5-8外显子限制性酶切片段的多态性。结果表明:在第6外显子上存在1个BglⅡ限制性酶切多态位点,被BglⅡ酶切开的基因型定为A、未被切开的定义为a。发现该位点基因型在健康和患病牙鲆中基因型分布频率不同,即患病牙鲆的基因型是Aa,健康牙鲆的基因型是AA。因此,可以推测牙鲆p53基因第6外显子BglⅡ限制性酶切位点的多态性可能与牙鲆患淋巴囊肿病的发生有关。研究还发现在牙鲆p53基因5-8外显子上存在大量多态性位点;在第5和第6内含子上存在由部分序列插入和缺失产生的多态性;在牙鲆肿瘤细胞中未检测到p53基因cDNA的突变。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1. 关于致癌基因和抑癌基因
• 2 p53 基因研究概况
• 2.1 p53 的结构
• 2.2 p53 的功能
• 2.2.1 p53与细胞周期调控
• 2.2.2 p53 与细胞凋亡
• 2.3 p53基因在几种肿瘤中的表达与意义
• 2.3.1 喉鳞状细胞癌（LSCC）
• 2.3.2 肺癌
• 2.3.3 肝细胞癌（HCC）
• 2.3.4 大肠癌
• 2.4 p53 的失活机理
• 2.4.1 p53 与蛋白质的相互作用
• 2.4.2 p53 基因突变
• 2.4.3 p53 突变与肿瘤
• 2.5 p53基因多态性与肿瘤
• 2.5.1 基因多态性概念
• 2.5.2 p53多态性类型
• 2.5.3 关于第72位密码子多态性的研究
• 2.5.4 第三内含子与第六内含子的多态性
• 2.6 基因多态性检测方法
• 2.6.1 建立在PCR 基础上的检测方法
• 2.6.2 基于构象变化的检测方法
• 2.6.3 基于多态性对核酸分子杂交影响的检测方法
• 2.6.4 基于测序技术的检测技术
• 3. 鱼类p53基因研究概述
• 4. 牙鲆淋巴囊肿病研究概述
• 5. 本研究的内容和意义
• 第二章 牙鲆p53 基因cDNA 克隆与组织表达
• 前言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 RNA 的提取
• 1.3 cDNA 的合成
• 1.4 牙鲆p53 基因核心区域的克隆
• 1.5 3’RACE
• 1.6 5’RACE
• 1.6.1 RNA 的提取
• 1.6.2 cDNA 第一链的合成
• 1.6.3 PCR扩增
• 1.7 序列分析
• 1.8 组织表达研究
• 2. 结果
• 2.1 牙鲆RNA的提取结果
• 2.2 牙鲆p53基因的克隆结果
• 2.3 牙鲆p53 基因编码蛋白质疏水性分析
• 2.4 牙鲆p53 基因编码蛋白质的结构分析
• 2.5 几种p53 氨基酸序列的进化分析
• 2.6 p53 基因组织表达检测结果
• 3. 讨论
• 第三章 牙鲆p53 基因的克隆与结构分析
• 前言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 牙鲆肌肉组织基因组提取
• 1.3 基因克隆
• 1.3.1 引物设计
• 1.3.2 PCR扩增
• 2. 结果
• 2.1 牙鲆肌肉组织DNA的电泳结果
• 2.2 牙鲆p53基因组扩增结果
• 2.3 牙鲆p53基因组序列
• 2.4 牙鲆p53基因结构分析
• 2.5 牙鲆p53 蛋白5 个高度保守区域在基因组上的位置分析
• 3. 讨论
• 第四章 牙鲆p53 基因多态性及与淋巴囊肿病关系的研究
• 前言
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 DNA 提取
• 1.3 淋巴囊肿病毒的检测
• 1.4 牙鲆p53 基因限制性酶切位点多态性检测
• 1.4.1 健康鱼与病鱼的BglⅡ酶切位点多态性检测
• 1.4.2 样品多态性序列测定
• 1.5 序列分析
• 1.6 统计学处理
• 2. 结果
• 2.1 淋巴囊肿病毒检测结果
• 2.2 扩增获得的健康牙鲆p53 基因组部分序列
• 2.3 BglⅡ酶切位点多态性类型
• 2.4 A和a型等位基因在患病和健康牙鲆中的基因频率分布
• 2.5 A和a型等位基因在患病牙鲆肌肉和瘤组织中中的基因频率分布
• 2.6 A和a型等位基因外显子序列分析
• 2.7 A和a型等位基因的内含子序列分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢