苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）因其高效、安全和对环境友好等特点而成为世界上应用最为广泛的昆虫病原微生物。它在形成芽胞的同时可以在细胞中积累形成规则形状的晶体,其主要成份是杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）,并且在细胞裂解时随芽胞一起释放。在苏云金芽胞杆菌杀虫剂的生产过程中,这种伴胞晶体可以达到发酵产物干重的25%以上。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因表达调控的研究对于明确Bt产生大量晶体的机制并在此基础上提高其产量具有重要意义。本文在构建了sigH突变体和sigK突变体的基础上,研究了cry8E基因的转录调控机制,并在转录水平和翻译水平上比较了cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子的活性。本研究采用同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株中sigH基因,构建了sigH基因缺失突变株HD△sigH。通过生长曲线测定表明突变体较出发菌株在对数生长期后期的生长速度较慢;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力;SDS-PAGE分析表明突变体丧失了表达Cry1Ac蛋白的能力;利用启动子融合lacZ基因技术在sigH突变体中监测了cry1Ac基因启动子的转录活性发现sigH基因的缺失导致cry1Ac启动子在芽胞分化前的细胞中转录活性上升,但在芽胞期母细胞中的转录活性明显降低,这表明sigH基因以某种方式调控Cry1Ac蛋白表达。说明sigH基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成和Cry蛋白高表达所必需。采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73菌株sigK基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK基因插入失活突变体。通过生长曲线测定表明突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力;SDS-PAGE分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株。利用载体pHT315携带sigK基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力。利用启动子融合lacZ技术在sigK突变体中监测了cry1Ac基因启动子的转录活性发现sigK基因的失活导致cry1Ac启动子的在T8后的转录活性降低。以上结果证明sigK基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量。通过对cry8E基因所在的大质粒进行序列分析发现cry8E基因上游存在一个orf1,其序列与cry2A、cry9Ca、cry9Ec、cry11A和cry18A操纵子中的orf1基因有很高的相似性,生物信息学分析表明orf1基因下游也没有典型的转录终止结构,通过RT-PCR的方法证明cry8E基因与其上游orf1基因是共转录的,说明cry8E基因与其上游orf1组成操纵子共转录。通过构建orf1和cry8E的启动子Porf1和Pcry8E与lacZ的融合表达载体,测定β-半乳糖苷酶的活性发现Porf1和Pcry8E都有启动子活性,说明cry8E基因表达是由两个启动子区控制的,分别位于orf1基因上游和orf1基因与cry8E基因之间。在orf1和cry8E基因间隔区存在启动子活性,这在cry基因启动子中尚属首次报道。对两个启动子区进行生物信息学分析表明这个orf1的上游存在σE的识别位点,推测其可能受σE因子调控,而orf1与cry8E基因的间隔区序列存在σH的识别位点,推测其可能受σH因子调控;分别在相应的突变体中测定其转录活性发现Porf1在sigE突变体中丧失了β-半乳糖苷酶的活性,5′-RACE方法测定orf1基因的转录起始位点和启动子的-35区和-10区,并且发现orf1基因的-35区和-10区与σE因子识别序列高度相似,综合以上结果说明orf1的启动子受σE调控;而Pcry8E在sigH突变体中的β-半乳糖苷酶活性显著低于其在野生型中的活性,5′-RACE方法测定cry8E基因的转录起始位点和启动子的-35区和-10区,并且发现其与σH因子识别序列高度相似,综合以上结果说明cry8E的启动子受σH调控。说明cry8E操纵子有两个非重叠的启动子,分别受σE因子和σH因子调控。orf1基因缺失导致cry8E基因启动子的转录活性上升,同时可以提高Cry8E蛋白的表达量,通过将orf1基因重新导入缺失orf1基因的菌株中发现,其转录活性又可以恢复,说明orf1基因的存在会抑制cry8E基因的表达。同时发现orf1基因的互补序列存在启动子活性,初步推测有可能是sRNA存在,但是其功能还有待于进一步研究。为在转录水平和翻译水平比较cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子的活性,构建了cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子与lacZ基因的融合表达载体,测定β-半乳糖苷酶的活性发现,cry8E基因启动子的转录活性最高;构建了cry1Ac、cry3A、cry4A和cry8E基因启动子与cry1Ac基因的融合表达载体,SDS-PAGE分析发现cry1Ac启动子所表达的蛋白产量最高;扫描电子显微镜观察发现4种启动子均可以使Cry1Ac蛋白形成菱形晶体。高活性启动子的筛选可为更进一步地提高杀虫晶体蛋白的表达水平和今后构建高效广谱工程菌具有重要的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 芽胞形成
• 2 芽胞杆菌中的Sigma 因子
• A'>2.1 Sigma 因子σ^A
• H'>2.2 Sigma 因子σ^H
• E'>2.3 Sigma 因子σ^E
• K'>2.4 Sigma 因子σ^K
• 3 杀虫晶体蛋白
• 3.1 杀虫晶体蛋白基因
• 3.2 杀虫晶体蛋白基因的定位
• 3.3 杀虫晶体蛋白的作用机理
• 3.4 Cry 蛋白的表达调控
• 4 对地下害虫具有杀虫活性的cry8 类基因
• 5 本研究的立题依据和目的意义
• 6 研究思路
• 第一章 sigH 基因缺失突变株的构建与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 仪器设备
• 1.3 研究方法
• 2 结果与分析
• 2.1 sigH 基因的克隆与序列分析
• 2.2 SigH 蛋白的生物信息学分析
• 2.3 sigH 基因缺失突变株的构建与鉴定
• 2.4 sigH 基因恢复菌株的构建
• 2.5 sigH 基因启动子的转录活性分析
• 2.6 sigH 缺失突变体的特点分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 sigK 基因插入失活突变株的构建与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 研究方法
• 2 结果与分析
• 2.1 sigK 基因插入失活片段的构建
• 2.2 sigK 基因突变质粒的构建与鉴定
• 2.3 sigK 基因突变体的筛选与验证
• 2.4 sigK 基因突变体遗传恢复菌株的构建与筛选
• 2.5 sigK 基因突变体的特点
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 苏云金芽胞杆菌cry8E 基因转录调控机制研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 研究方法
• 2 结果与分析
• 2.1 cry8E 操纵子Locus 序列分析
• 2.2 cry8E 操纵子Locus 的RT-PCR 分析
• 2.3 cry8E 操纵子启动子区鉴定
• 2.4 orf1 基因启动子转录调控研究
• 2.5 cry8E 基因启动子转录调控研究
• 2.6 cry8E 操纵子启动子区的转录活性分析
• 2.7 cry8 类基因启动子的生物信息学分析
• 3 讨论
• 3.1 cry8E 操纵子的启动子及其调控类型
• 3.2 转录起始位点测定
• 4 小结
• 第四章 orf1 基因功能的初步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 研究方法
• 2 结果与分析
• 2.1 ORF1 生物信息学分析
• 2.2 orf1 缺失对cry8E 启动子区转录活性影响
• 2.3 orf1 基因缺失对Cry 蛋白表达的影响
• 2.4 orf1 基因反向启动子活性发现
• 2.5 orf1 基因互补试验
• 2.6 ORF1 细胞定位
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 苏云金芽胞杆菌cry 基因启动子活性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 研究方法
• 2 结果与分析
• 2.1 pHTlac 载体构建
• 2.2 载体构建
• 2.3 cry 基因启动子转录活性比较
• 2.4 不同启动子指导的 Cry1Ac 蛋白表达载体构建
• 2.5 晶体形态观察
• 2.6 不同启动子指导的 Cry1Ac 蛋白产量分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢