论文摘要
背景T淋巴细胞识别、活化是免疫反应的核心问题，也是免疫学中发展最快的研究领域之一。在分子水平上了解免疫识别活化的机制，不仅可以对机体免疫系统的运作有更深入的理解，而且对解析临床免疫相关疾病的发病机制、发展新的诊断和治疗技术均具有极大的帮助。也正是近十几年来在T细胞识别活化研究领域所取得的一些重大进展推动了肿瘤、移植、病毒感染及自身免疫性疾病的临床诊断和治疗。然而，在T细胞免疫识别活化研究中仍有许多的机理尚未完全解析，很多新的发现在充实原有理论的基础上又提出了新的命题。经典的免疫学理论克隆选择学说认为具有自身反应受体的“禁忌”T／B细胞克隆在发育过程中经历阴性选择（negative selection）被清除或失活成为克隆无能（anergy），而具有其他抗原特异性受体的T／B细胞将得以进一步成熟，并进入外周淋巴组织行使其功能，T细胞迁出胸腺后其重排机制关闭，不再表达重组活化基因（recombination activating genes，RAGs）和发生受体基因重排（rearrangement）。然而，近二十年来国外一些实验室的研究结果对这一学说提出了挑战，新的研究发现，免疫系统除了细胞克隆选择（clone select）之外，还存在受体分子水平的选择，在细胞选择之前先通过受体可变区（variable，V）、多样区（diversity，D）、连接区（joining，J）基因重排改变其抗原特异性，以一种全新的受体取代原有的受体，从而逃避清除或凋亡。受体的第二次重排（second rearrangement）不仅可以发生于发育早期不成熟的T／B淋巴细胞中，也可发生于外周成熟T／B淋巴细胞中，前者称为受体编辑（receptor editing），后者称为受体修正（receptor revising）。受体编辑多发现于胸腺阳性／阴性选择过程中，若缺乏阳性选择配体（合适的MHC），TCR a位点将触发持续重排（continued rearrangement）直到新表达的TCR通过阳性选择（positive selection）；而在阴性选择过程中，自身反应T细胞启动TCR二次重排，使原表达的自身反应受体内化，重排后编码并表达非自身反应受体，细胞在阴性选择之前获救，避免被清除或凋亡。受体修正则多见于病毒感染的免疫反应过程中，病毒超抗原可通过两种途径诱导外周成熟T细胞耐受，一个是克隆凋亡或清除，另一个是受体修正。为避免抗原特异性T细胞大量凋亡，细胞修正其受体，转为表达非特异性受体而获救，修正后的受体不再识别耐受原，从而机体对病原微生物不再发生反应。目前已公认受体编辑在胸腺阳性／阴性选择机制和维持自身免疫耐受以及塑造多样性淋巴细胞受体库（repertoire）中发挥了重要作用。而受体修正的研究结果虽然较具争议性，但对于认识和理解自身免疫和淋巴细胞反应亲和力成熟以及肿瘤和病毒感染的免疫逃逸机制等免疫学重大问题则更具潜在意义。理论而言，受体编辑／修正与自身免疫病的关系非常密切，或许在冲破机体自身免疫耐受以及自身免疫病的发生发展过程中占据了重要的角色。首先，对于机体自身免疫耐受而言，受体编辑是一柄双刃剑，一方面它通过编辑淋巴细胞表面受体改变自身抗原特异性使细胞在克隆选择之前获救，细胞可以免于凋亡或清除；另一方面这种看似较为经济的方式，却造成了部分T／B细胞因此而成为更严重的潜在自身反应细胞。比如在aβT细胞中，TCRβ基因遵循等位排斥原则，一个细胞表面仅表达一个功能性TCRβ链。但该原则并不适用于TCR a基因，表达了第一次重排的a链后重排并未终止，仍然持续发生受体编辑，由于缺乏等位基因排斥，重排可能发生于另一条染色体上，导致单个T细胞包含两套重排的TCR a基因，甚至同时表达两种TCRs，其潜在危险是致使自身反应TCR逃避胸腺阴性选择。因为选择可发生于细胞表面受体中的任何一个，而未经选择的另一个TCR则可能具有自身反应性。携带自身反应受体的T细胞进入外周将发育成为自身攻击性T细胞，成为日后发展自身免疫病的“隐患”。其次，外周成熟T／B细胞与肿瘤、病毒等反应后发生受体修正，由于外周缺乏中枢“阴性选择”的微环境，这种重排形成的TCR／BCR若具有自身反应性，则可能无法消除。因此，TCR／BCR的二次重排，在维持自身免疫耐受或在应答肿瘤和病毒感染、增加T／B细胞受体库而避免凋亡和清除的同时，却不可避免的出现副作用----潜在的或更为严重的自身反应性。不仅理论上受体编辑与自身免疫联系紧密，在实际研究中也发现，自身免疫病患者体内的抗原受体编辑非常活跃。在炎症活动期系统性红斑狼疮病人外周血以及类风湿性关节炎病人的滑膜组织中可检测到RAGs和TdT的表达，且狼疮患者比正常人存在更多的轻链编辑。在有自身免疫倾向的NZB小鼠和MRL小鼠中也有高水平的RAGs mRNA表达和Ig基因重组的现象。而且不论是人类SLE还是动物模型都比正常对照组存在更多D-D融合、二次D-JH重排、VH置换之类异常重排，这些异常的重排往往能够提高抗体或抗原受体与DNA或核酸的结合亲和力。在非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠模型中发现外周自身免疫T细胞a链的重排以及病毒超抗原诱导TCR a链位点的断裂和第二次重排，则提示TCR二次重排可能是产生自身免疫T细胞的一种途径。诚然，TCR二次重排与自身免疫病、肿瘤、病毒感染等临床免疫相关疾病关系密切，研究TCR二次重排的理论意义和潜在临床应用价值重大，但因其涉及的机制非常复杂，目前并未取得突破性进展，。大多受体修正的结果来源于基因敲除鼠和转特异性TCR基因动物的实验，这应用到正常的生理背景中具有明显的局限性。人的外周TCR二次重排研究则多发现于一些“特殊的T细胞亚群”或一些“特殊部位”的T细胞，并且倾向认为这些重排的证据来源于刚从胸腺迁出的未发育成熟的初始T细胞尚未完全关闭的一次重排，而并非重新激活开放引起的二次重排。TCR二次重排究竟是一个普遍存在的现象，还是仅发生于特定发育阶段或特定T细胞亚群或特定解剖学部位或特定疾病背景下的一个特殊现象?其产生的机制和意义是什么?与疾病的发生发展有何关系?在详细机制的研究无法获得突破的前提下，开展大量临床疾病监测或许能为受体编辑／修正的研究开辟新的局面。目的整合已有的工作基础，完善TCR二次重排的研究方法和体系，为检测系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者外周血单个核细胞（peripheralblood mononuclear cell，PBMC）中aβT细胞TCR二次重排研究提供可靠的监测技术和有效的分析手段：检测SLE患者外周血重排主要调节蛋白RAG1／RAG2、末端脱氧核糖核酸转移酶（terminal deoxynucleotidy transferase，TdT）、Ku70&Ku80连接蛋白mRNA的表达，巢式PCR（nest-PCR）方法检测SLE中aβT细胞TCR BD-BJ基因重组伴随产物TCR重排删除环（TCR excision circles，TRECs）、连接介导PCR方法（Ligation-Mediated-PCR，LM-PCR）检测SLE中aβT细胞TCR BD-BJ基因重组信号序列（recombination signal sequences，RSS）断裂末端。为TCR二次重排与疾病关系、疾病中TCR aβT细胞的免疫应答机制、SLE的发病机制研究提供基础；更重要的是，为T细胞相关临床疾病提供新的研究平台。检测SLE患者PBMC中aβT细胞TCR 32 AV家族和24 BV家族的表达，结合监测人TCR CDR3谱系漂移的免疫扫描谱型分析技术（immunoscopespectratyping technique）监测SLE完整的a和β链双链TCR CDR3的多态性和长度分布，动态监测不同病程CDR3谱型的变化，筛选疾病相关的单／寡克隆增生T细胞家族，测序鉴定其TCR CDR3区基因序列并模拟出其蛋白质三维结构，为筛选具代表性的自身反应T细胞家族进行体外二次重排研究打下基础，为SLE的诊断、治疗研究和疫苗的研制提供数据。方法（1）以胎儿胸腺组织、T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat和正常人外周血PBMC为研究对象（可分别作为SLE样本的阳性、阴性对照。参照文献和本实验室以前的研究，Jurket的重排体系是开放的，可与胸腺一同作为阳性对照）。合成参与基因剪切和连接的主要调控蛋白：RAG、TdT、Ku70、Ku80的上下游引物，扩增并检测各蛋白mRNA的表达；合成与双链RSS平断裂末端相接的特殊接头BW Linker及其引物，提取各样本的总DNA与BW-Linker连接，在人TCRBD1和BD2基因的5’端前和3’端后分别合成两条内、外侧引物，巢式PCR扩增，阳性产物测序鉴定；在TCR BJ1和BJ2基因5’端各合成3条上游引物，TCR BD1和BD2基因3’端各合成2条下游引物，PCR扩增BD1与6个BJ1片段、BD2与7个BJ2片段重排时可能形成的TCR BD-BJ信号结合T细胞受体删除DNA环（signal joint TCR excision DNA circles，sjTRECs）。（2）以Jurkat和正常人PBMC为研究对象，提取各样本总RNA，优化并合成人aβT细胞TCR 32 AV（a chain variable gene，AV）家族和24 BV（βchainvariable gene，BV）家族上游引物和共用AC（a chain constant gene）和BC（βchainconstant gene）下游引物（下游引物内侧端带FAM标记），扩增并检测样本各AV、BV基因家族CDR3区段cDNA，采用免疫扫描谱型分析技术，分析单克隆水平Jurkat细胞TCR a和β链的基因家族及其CDR3区基因序列和群体多克隆水平正常人PBMC中TCR aβT细胞的CDR3谱型。（3）以明确诊断的20例临床SLE患者PBMC为研究样本，提取总RNA，逆转录成cDNA，扩增并检测重排主要调节蛋白RAG、TdT、Ku70、Ku80等mRNA的表达；提取各样本的总DNA与BW-Linker连接，再分别以人TCR BD1和BD2基因的5’端前和3’端后的内、外侧引物与BW-Linker引物，进行巢式PCR，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物；提取各样本的总DNA，巢式PCR扩增BD1与6个BJ1片段、BD2与7个BJ2片段重排时可能形成的sjTRECs。（4）以明确诊断的20例临床SLE患者PBMC，和3例不同病程时收集的患者PBMC为研究样本，提取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增各32 AV家族和24 BV家族CDR3区基因，采用免疫扫描谱型分析技术检测aβT细胞TCRCDR3多态性和长度分布，并选取部分单／寡克隆增生的TCR AV和BV家族RT-PCR产物进行测序，生物信息学分析和模拟TCR蛋白质三维结构。结果（1）在胸腺组织、Jurkat细胞中均检测到RAG1和RAG2 mRNA的表达，正常人PBMC仅检测到RAG1mRNA，对Jurkat细胞RAG1和RAG2 RT-PCR产物测序结果表明，序列与GeneBank报道序列完全一致。胸腺组织、Jurkat细胞的TdT、Ku70、Ku80 mRNA均在特定位置出现片段大小对应的特异条带，正常人PBMC除未检测到TdT外，其余均检测到。在胸腺DNA中，同时检测到BD1RSS、BD2 RSS 5’端和3’端四个断端，而在Jurkat DNA中检测到BD2 RSS 5’端和3’端两个断端，正常人PBMC未检测到RSS断端。胸腺DNA中检测到BD1-BJ1 sjTRECs S1、S2、S4、S5、S6以及BD2-BJ2 sjTRECs S1、S2、S4、S5。PBMC中检测到BD1-BJ1 sjTRECs S1、S4以及BD2-BJ2 sjTRECs S2。Jurkat细胞中检测到BD2-BJ2 sjTRECs S1、S5。（2）Jurkat细胞TCR 32AV和24BV家族RT-PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳显示仅AV1.1和BV8家族出现特异条带；6％变性聚丙酰胺凝胶电泳分析AV1.1和BV8家族产物均显示单一条带，进一步自动扫描AV1.1和BV8基因家族显示均呈单峰；正常人PBMC中TCR AV和BV各家族产物在2％琼脂糖凝胶上均显示模糊条带，6％测序胶电泳分析各家族产物均显示8条或8条以上条带，自动分析峰型，各家族均为8个或8个以上中间高两端低的高斯（Gaussian distribution）分布钟型峰图，相邻两条带大小相差约3bp，各家族CDR3表达频率接近，但呈现不同的多态性和长度分布；（3）20例患者中均检测到RAG1、RAG2、Ku70、Ku80 mRNA的表达，16例患者中检测到TdT mRNA的表达，在两例患者中检测到BD1 RSS 3’和5’断端。20例患者中均检测到sjTRECs环，多数检测到的为BD1-BJ1 sjTRECs S1、S2、S4和BD2-BJ2 sjTRECs S1、S2、S4。20例SLE患者PBMC中TCR 32AV和24BV家族RT-PCR产物，多数在2％的琼脂糖凝胶电泳图上显示一条模糊的条带，部分家族未显条带；在6％变性聚丙酰胺凝胶电泳图上，多数家族显示8条以上条带，部分家族显示少于8条带或未显带；利用GeneScan 672软件进一步自动分析显示20例患者的CDR3谱型，呈现单峰、寡峰、偏峰，部份家族表达频率极低或缺失；某些家族出现单／寡克隆性增生的频率较高，例如TCR AV8，AV14，AV23，AV30，AV31，BV2，BV8，BV11，BV14，BV16，BV19和BV24家族；比较病人不同病程检测到的CDR3谱型，发现随着疾病的进展，出现了不同的单／寡克隆增生家族。对SLE患者部分单／寡克隆扩增的家族进行测序分析，发现存在GGX氨基酸保守序列和高频出现的Ja34、Jβ2s1和Jβ2s7基因片断。结论（1）我们采用的检测RAG1、RAG2、Ku70、Ku80、TdT这几种重排主要调控蛋白mRNA表达的RT-PCR方法、检测重组中间产物RSS断端的LM-PCR方法以及检测重排删除环sjTRECs的巢式PCR方法，经实验证明稳定、可靠，可作为研究SLE aβT细胞TCR二次重排的研究平台。监测人aβT细胞TCRCDR3谱系漂移的免疫扫描谱型分析技术，是一种相对简便、可靠、灵敏度高的特异T细胞研究技术，不仅能监测单克隆细胞TCR的分子特征和变化，还能监测群体多克隆样本中各家族CDR3表达和频率的动念变化并筛选单／寡克隆增生的特异T细胞进行测序和生物信息学分析，这些重排相关的检测技术能为TCR二次重排与肿瘤、自身免疫病等的关系研究提供方法；（2）在SLE患者PBMC中检测到RAG2、TdT mRNA的表达，在两例患者中均检测到BD1 RSS 3’、5’断端，这有别于正常人PBMC中的检测结果。进一步提示，SLE患者外周很可能存在TCR二次重排。然而由于临床采集的样本量、时间、经费、实验条件以及自己早期对课题的把握不足等诸多原因，我们目前所做的工作非常粗浅。进一步的工作需要开展SLE体内和体外二次重排研究两条线路。在体内研究方面需扩大样本，对重组参与蛋白进行mRNA和蛋白质两个水平的定量分析；对sjTRECs进行测序和荧光定量分析；对检测到的RSS断端进行序列鉴定，同时设置好大样本的正常人对照，使得量化对比的数据具备统计学意义。在体外研究方面要分两个部分进行，首先依据我们对SLE患者TCR CDR3谱型的监测，筛选出具有代表性的单克隆自身反应T细胞家族，利用家族特异性单抗将其分选出来（目前国外已有TCR 24个Vβ家族单抗出售），在体外进行重排的检测，其次，在体外建立SLE患者自身反应细胞系，尝试体外人工诱导二次重排，从单克隆细胞水平监测TCR基因和蛋白的变化，并对信号转导途径进行实时监测。实验研究将为SLE的免疫发病机制研究提供新的方向，更重要的是，为T细胞相关临床疾病提供新的研究平台。（3）SLE患者PBMC中T细胞存在明显单寡克隆增生和偏峰现象，单／寡克隆增生T细胞α和β链CDR3区有着不同的序列和结构，提示应答T细胞TCR的分子特征与自身抗原和个体HLA多样性有关，不同病人存在相同的单寡克隆增生家族和保守序列以及高频使用的J基因片断，这种限制性使用的家族和片断可能与同类的或相似结构的自身抗原相关。随着疾病的进展，在不同病程中监测到T细胞α和β链各家族CDR3谱型均有不同程度的改变，提示在不同的炎症活动期存在不同的单寡克隆家族行使自身反应功能。对比20例病人的CDR3谱型，发现SLE DAI评分越高（表明疾病的活动度越强，病情越重）的患者，其体内存在的异常增生家族越多，其CDR3谱型较正常人有着更大程度的偏移。分析和鉴定不同病程中单寡克隆扩增的自身抗原特异性T细胞TCR序列和结构，将为发展新的SLE的诊断技术、特异T细胞相关的个性化治疗、自身抗原T细胞表位疫苗的筛选提供方法和手段，也为筛选具代表性的单克隆自身反应T细胞家族进行体外二次重排研究打下基础。
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