猴头菌等药用真菌中神经活性成分的筛选、分离纯化及结构鉴定

论文摘要

老年性痴呆,是一种原因不明以认知功能减退为主要临床表现的神经系统退行性疾病。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤来源的未成熟神经元的细胞系,广泛用于神经系统疾病的病理研究乖药物筛选。在中国药用真菌作为药物用于治疗疾病已经有2000多年的历史。药用真菌中含有多糖、萜类、黄酮等多种生物活性成分,具有免疫调节、抗癌、抗菌和神经营养等众多药理作用。目前已发现灵芝、猴头菌等多种药用真菌具有神经营养和神经损伤保护作用,但研究主要集中在促PC12细胞突起生长方面,而采用活性跟踪手段对药用真菌中神经活性物质进行系统的分离纯化和活性研究的工作未见报道。本研究建立PC12神经突起生长模型和PC12细胞氧化应激损伤模型,对猴头菌等4种药用真菌提取物进行了促神经突起生长和氧化应激损伤保护作用研究,并采用活性跟踪的方法对猴头浸膏进行了分离纯化。研究发现,部分灵芝菌株和猴头脂溶性提取物有一定的促PC12细胞神经突起生长作用,但是作用并不显著。在4种药用真菌中,均发现了具有一定氧化应激损伤保护作用的菌株和有效部位。GC15的活性最好,但活性不是随着作用浓度的增加而增加,样品浓度为50μg/mL时活性最好,细胞存活率为（88.36±1.8）%。DT4在样品浓度为50μg/mL时活性最好,细胞存活率达到（68.23±0.3）%。HW样品在50μg/mL时活性最好,细胞存活率为（78.08±3.1）%。FC5在样品浓度为150μg/mL时活性最好,细胞存活率为（81.2±3.1）%。本研究对猴头浸膏活性较好的HE和HC部分进行了分离纯化,得到的大多组分在实验浓度范围内具有一定氧化应激保护作用。在5个萃取部分中,HE的活性随着浓度增高而增高,样品浓度为5μg/mL时细胞存活率为（40.35±1.1）%,样品浓度为50μg/mL时细胞存活率为（63.53±4.1）%,样品浓度为150μg/mL细胞存活率为（69.26±3.3）%,对其进行柱层析分离后,得到的HE5-1-3,样品浓度为5μg/mL时细胞存活率为（42.54±3.2）%,样品浓度为50μg/mL时细胞存活率为（50.48±0.5）%,样品浓度为150μg/mL细胞存活率为（62.33±1.3）%。对HC其进行柱层析分离后,得到的HC3-7-1,样品浓度为5μg/mL时细胞存活率为（46.37±6.1）%,样品浓度为50μg/mL时细胞存活率为（58.73±4.1）%,样品浓度为150μg/mL细胞存活率为（61.44±2.7）%。分离纯化得到两个化合物活性均有一定氧化应激保护作用,但是活性却下降。本研究将猴头浸膏用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取分段,采用活性跟踪手段,分别利用氯仿甲醇系统、石油醚丙酮系统等对硅胶柱梯度洗脱,根据TLC结果合并。对猴头浸膏乙酸乙酯萃取部分和氯仿部分进行分离纯化后,得到两个化合物,经氯仿甲醇、甲醇水等正反相系统TLC分析确定为单一化合物,根据1H-NMR、13C-NMR谱图、质谱等,确定了他们的结构。化合物HE5-1-3-1为3-吡啶酰胺,即尼克酰胺。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 名词缩写
• 第一章 文献综述
• 第一节 老年性痴呆病理与药物研究
• 1.氧化应激与老年性痴呆
• 1.1 氧化应激学说
• 1.2 老年痴呆症中氧化应激的来源
• 1.3 老年痴呆症中的抗氧化因素
• 2.神经生长因子NGF与老年痴呆症
• 2.1 神经生长因子家族
• 2.2 神经生长因子结构和功能
• 2.3 神经生长因子NGF与老年性痴呆
• 3.天然产物中的神经活性成分研究
• 3.1 天然产物中神经营养成分的研究
• 3.2 天然产物中清除自由基的活性成分研究
• 3.3 药用真菌中神经活性成分的研究
• 4.PC12细胞与老年痴呆症药物研究
• 5.针对氧化应激老年痴呆症的治疗策略
• 第二节 猴头菌的研究概况
• 1.猴头菌的生物学研究概况
• 2.猴头菌的化学成分
• 2.1 多糖类物质
• 2.2 萜类物质
• 2.3 酚类物质
• 2.4 甾醇类物质
• 2.5 吡喃酮类物质
• 2.6 脂肪酸类物质
• 2.7 氯化苔黑酚衍生物
• 2.8 腺苷化合物
• 3.猴头菌的药理作用
• 3.1 抗溃疡和抗炎症作用
• 3.2 抗肿瘤作用
• 3.3 神经营养作用
• 3.4 保肝作用
• 3.5 降血糖作用
• 3.6 抗突变作用
• 3.7 抗疲劳作用
• 3.8 抗辐射作用
• 3.9 提高机体耐缺氧能力
• 3.10 增加心肌血液输出量,加速肌体血液循环
• 4.临床应用研究
• 4.1 治疗消化道溃疡
• 4.2 治疗慢性胃炎
• 4.3 治疗慢性乙型肝炎
• 4.4 治疗复发性口疮
• 5.小结
• 第三节 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 一、材料
• 1 仪器
• 2 试剂
• 2.1.化学试剂
• 2.2.细胞培养试剂
• 2.3.细胞活力显色剂
• 3 材料
• 3.1 猴头菌浸膏
• 3.2.生物活性测定供试样品
• 3.2.1 猴头菌分离纯化不同组分
• 3.2.2 灵芝水溶性提取物和灵芝脂溶性提取物
• 3.2.3 金耳脂溶性提取物
• 3.2.4 鸡腿菇脂溶性提取物
• 4 细胞株
• 二、方法
• 1 神经活性成分筛选模型
• 1.1.样品的制备
• 1.2.阳性对照NGF溶液的配置
• 1.3.PC12细胞的培养
• 1.4.促PC12细胞神经突起生长试验
• 1.4.1 正常血清培养基试验
• 1.4.2 无血清培养基试验
• 1.4.3 低血清培养基试验
• 1.5.氧化应激损伤试验
• 2O₂浓度的确定'>1.5.1 H₂O₂浓度的确定
• 1.5.2 氧化应激损伤模型的建立
• 2 猴头菌浸膏的分离纯化
• 2.1.猴头菌浸膏的萃取
• 2.2.HE部分的分离纯化
• 2.2.1 HE5的分离纯化
• 2.2.2 HE5-1的分离纯化
• 2.3.HC部分的分离纯化
• 2.3.1 HC3部分的分离纯化
• 第三章 结果与分析
• 一、样品的促PC12细胞神经突起生长作用
• 1.神经生长因子NGF的作用
• 2.正常血清培养条件下样品的作用
• 3.无血清培养条件下样品的作用
• 4.低血清培养基条件下样品的作用
• 5.结果与讨论
• 二、样品对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用
• 1.PC12细胞氧化应激损伤模型的建立
• 2O₂浓度的确定'>1.1 H₂O₂浓度的确定
• 1.2 阳性对照NGF浓度的选择
• 1.3 结果与讨论
• 2.样品的保护作用
• 2.1 灵芝脂溶性提取物的保护作用
• 2.2 金耳脂溶性提取物的保护作用
• 2.3 猴头菌脂溶性提取物的保护作用
• 2.4 鸡腿菇脂溶性提取物的保护作用
• 2.5 结果与讨论
• 3.猴头浸膏分离纯化各部分的保护作用
• 3.1 猴头浸膏萃取各部分的保护作用
• 3.2 HE分离纯化各部分的保护作用
• 3.3 HE5分离纯化各部分的保护作用
• 3.4 HC分离纯化部分对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用
• 3.5 HC3分离纯化部分对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用
• 三、化合物的结构鉴定
• 1.HE5-1-3-1的结构鉴定
• 第四章 讨论
• 1.灵芝和猴头提取物对PC12细胞的促神经突起生长作用
• 2.药用真菌脂溶性提取物对PC12细胞氧化应激损伤的保护作用
• 3.猴头浸膏的分离纯化
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表文章情况