瞬时受体电位通道M7蛋白对大鼠肝星状细胞系HSC-T6凋亡的影响

瞬时受体电位通道M7蛋白对大鼠肝星状细胞系HSC-T6凋亡的影响

论文摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,是慢性肝病最常见的病理改变之一。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖是肝纤维化发生的中心环节[1]。活化的HSC转化为肌成纤维细胞,合成大量细胞外基质(extra cellular matrix,ECM),导致细胞外基质合成和降解失衡,在肝脏内沉积。肝纤维化继续发展可演变成为肝硬化乃至肝功能衰竭[2]。众多研究发现,肝纤维化属可逆性病变,去除损伤因素或者应用抗纤维化药物,随着恢复时间延长,肝纤维化可以部分或者完全的逆转恢复,表现为沉积的胶原降解,肝脏结构和肝脏功能的恢复。在肝纤维化逆转这一过程中起关键作用的是肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的凋亡。有学者研究证实[3],在肝纤维化恢复阶段,活化的HSC可通过表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosisinducing-ligand,TRAIL)及其他凋亡刺激因子从而促进HSC的凋亡,促进ECM的降解。因此,诱导肝星状细胞凋亡成为促进肝纤维化恢复的重要途径之一。目前,已经有研究表明,PDGF可增强HSC细胞膜Na/H+泵(NHE)活性,使细胞内PH值增加,促进HSC增殖,NHE活性的增加可能依赖于钙离子-钙调蛋白及蛋白激酶C (PKC)途径[4]。醛固酮拮抗剂烯睾丙内酯可通过抑制PDGF诱导的NHE活性而抑制PDGF对HSC的促增殖效应[5];选择性的NHE抑制剂cariporide可明显抑制在体及离体状态下PDGF诱导的大鼠HSC增殖[6]。上述研究提示HSC中离子浓度的改变可影响HSC的活化增殖,HSC细胞膜上的离子通道成为调控HSC增殖与凋亡的新靶点。瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels, TRP channel)是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道。瞬时受体电位M7通道(transient receptorpotential melastatin7,TRPM7)是TRP家族成员之一,是一种具有离子通道和蛋白激酶双重功能的膜蛋白[7,8]。TRPM7广泛存在于机体组织中,参与细胞的增殖、迁移、凋亡等多种病理生理过程[9,10]。我课题组的前期研究表明[11],下调TRPM7的表达可显著抑制HSC-T6的活化与增殖。TRPM7对HSC的凋亡是否有影响,其确切机制如何目前尚不清楚。本研究选用大鼠肝星状细胞系HSC-T6为研究对象,探讨瞬时受体电位M7通道蛋白对活化的肝星状细胞凋亡的影响。研究内容包括以下三个部分:1. TRPM7在大鼠肝星状细胞系HSC-T6中的表达本实验通过体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,RT-PCR和Western blot检测HSC-T6中TRPM7的表达情况。结果显示,活化的HSC-T6,TRPM7的表达明显高于正常HSC。TRPM7阻断剂Gd3+或2-APB,能够降低HSC-T6中TRPM7mRNA和蛋白的表达。特异性的TRPM7-siRNA能够显著下调HSC中TRPM7mRNA和蛋白的表达水平。2.抑制TRPM7表达对大鼠肝星状细胞系HSC-T6凋亡的影响采用MTT比色法测定TRPM7阻断剂Gd3+或2-APB对HSC的增殖抑制率;RT-PCR检测细胞中Caspase-3、α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA的表达水平;Western blot检测细胞中Caspase-3蛋白的表达水平;Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3活性变化;流式细胞术检测HSC凋亡率变化。结果显示,Gd3+或2-APB在一定范围内抑制HSC-T6的增殖(P<0.01)。给予TRPM7阻断剂Gd3+或2-APB,HSC-T6的凋亡率、Caspase-3的mRNA、蛋白及活性检测均明显增加(P<0.01)。同时,Gd3+或2-APB能够降低活化的HSC中肝纤维化标志物α-SMA和Ⅰ型胶原mRNA的表达(P<0.01)。利用LipofectamineTM2000将特异性TRPM7-siRNA转染到HSC-T6内,下调瞬时受体电位通道M7蛋白(TRPM7)在大鼠肝星状细胞系HSC-T6中的表达。分别运用流式细胞术检测HSC-T6凋亡变化;Western blot检测Caspase-3蛋白的表达;RT-PCR检测Caspase-3、Bid mRNA的表达。结果提示,与正常组或对照组相比,TRPM7-siRNA转染组细胞凋亡率、凋亡蛋白Caspase-3及凋亡基因Bid的表达均明显上调。3. TRPM7对TRAIL诱导的HSC-T6凋亡的作用给予TRAIL诱导活化的HSC-T6凋亡,HSC的凋亡率、Caspase-3的mRNA、蛋白及活性检测均明显增加(P<0.01)。活化的HSC在给予TRAIL诱导凋亡之后,再给予TRPM7阻断剂抑制TRPM7的表达,活化的HSC-T6的凋亡率、Caspase-3的mRNA、蛋白及活性检测结果均进一步增加(P<0.01)。综上,本实验证明了TRPM7阻断剂Gd3+或2-APB能够提高由TRAIL诱导的活化HSC的凋亡,并降低肝纤维化标志物的表达水平;沉默TRPM7的表达可显著促进HSC的凋亡,其促凋亡机制可能通过线粒体途径由Bid介导,提示TRPM7通道可能是调控HSC凋亡的重要靶点,为肝纤维化的治疗提供新的思路。

论文目录

  • 英文缩略词表
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 实验材料
  • 实验方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 综述
  • 参考文献
  • 相关论文文献

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