论文摘要
肺癌是当今世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。在我国城市居民癌症死亡人群中,肺癌高居首位。尽管近30年来随着基础与临床医学的发展,对肺癌的诊断及治疗水平有了很大提高,但对其发生发展的认识以及治疗的效果远未达到令人满意的程度。目前认为癌症是一种多基因疾病,环境与遗传因素相互作用导致了癌症的发生发展,在注意环境因素预防的同时,对癌症相关基因的研究已成为二十一世纪癌症研究的热点。α1抗胰蛋白酶是一种重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂。研究显示在白种人群中,α1AT缺乏和慢性阻塞性肺疾病及肺癌有关联。在白种人群中和肺癌易感性有关联的Z、S基因型,据报告在我国汉族人群中很少见。目前α1AT基因多态性和我国汉族人群肺癌易感性的关系尚无定论。α1AT在多种肿瘤细胞中有表达,研究提示α1AT和癌症预后似有一定的相关性。有关α1AT与肺癌预后关系的研究尚未见报告,有待探索。研究目的:研究在我国陕西地区居住的汉族人群中α1AT基因多态性和肺癌易感性关系;探讨α1AT在肺癌组织中的表达与肺癌生物学行为之间的关系及可能机制;研究α1AT对人肺腺癌细胞系A549生长的影响及可能机制。研究方法:1.采集陕西地区居住的汉族人血标本330例,包括肺癌组130例,COPD组100例,对照组100例。采用PCR-RFLP技术,筛查α1AT基因外显子Ⅴ、Ⅲ及3’端突变体出现的频率,分析其与肺癌的关系。2.收集肺癌组织标本107例,其中鳞癌45例,腺癌42例,小细胞癌20例。用免疫组化SP法检测α1AT、CD3、Fas、FasL、DcR3的表达,分析α1AT与肺癌的组织类型、临床分期、分化程度、淋巴结转移的关系,并分析α1AT与CD3、Fas、FasL、DcR3表达的相关性,探讨作用机制。3.培养人肺癌细胞系A549,采用RT-PCR的方法克隆人α1AT基因编码区cDNA,构建α1AT的真核表达载体;用脂质体介导转染A549细胞,G418筛选稳定转染的细胞系;绘制生长曲线,Annexin V法及Hoechst法检测细胞凋亡。应用RT-PCR、Western blot法分别检测α1AT、Fas、FasL、DcR3的mRNA和蛋白表达的变化;探讨α1AT的过表达对A549细胞生长与凋亡的影响,及对Fas、FasL、DcR3表达的作用。实验结果:1.检测到α1AT的Z、S基因型存在,但在肺癌组、COPD组、对照组中分布无明显差异;非小细胞肺癌组发现3’端突变体（3m型基因）28例（21.5%）,COPD组7例（7%）,均明显高于对照组,统计学分析显示肺癌组、COPD组与对照组之间3m型基因分布差异显著（P=0.000）;将肺癌组进一步分组分析发现肺癌合并COPD组3’端突变体出现率42%,远高于肺癌不合并COPD组（8%）;3m型基因阳性患者罹患NSCLC合并COPD的OR值为7.552。2.鳞癌、腺癌、小细胞癌α1AT的阳性率分别为80.0%、76.2%、40.0%,α1AT的阳性强度检验显示鳞癌、腺癌无明显差异,但二者与小细胞肺癌比较差异显著;非小细胞肺癌临床分期越晚、细胞分化程度越低、伴有淋巴结转移,则α1AT蛋白表达也越低。3.非小细胞肺癌组织中α1AT蛋白表达越高,CD3阳性表达就越高,即肿瘤浸润淋巴细胞数量就越多。4.非小细胞肺癌组织中α1AT蛋白的高表达,伴随Fas、FasL的高表达和DcR3的低表达,α1AT和Fas、FasL成正相关,和DcR3成负相关,相关检验有显著性。5.构建成功α1AT真核表达载体,并成功转染A549细胞,获得高表达α1AT的稳定转染的A549细胞株。6.体外培养状态下,转染α1AT的A549细胞生长缓慢,生长曲线低平,Annexin V及Hoechst凋亡检测提示,转染α1AT的A549细胞凋亡增加,与未转染及转染空载体的A549细胞相比,有显著差异（P<0.01）。7. RT-PCR、Western blot检测发现转染α1AT真核表达载体的A549细胞α1AT的表达明显增加,α1AT在转录和蛋白翻译水平都上调Fas、FasL的表达,下调DcR3的表达。结论:1.α1AT的Z、S基因型在陕西地区居住的汉族人群中存在,发生率并不似国内报告的那么低,但它们和汉族人群COPD及肺癌无明确的相关性;而3’端突变体在COPD和肺癌患者中明显增多,是COPD和肺癌的易感因素。携带3’端突变体的人群患肺癌合并COPD的危险性明显增高,提示α1AT的3’端突变体和汉族人群中肺癌的易感性相关。2.鳞癌、腺癌组织中α1AT蛋白表达阳性率明显高于小细胞肺癌;非小细胞肺癌临床分期越晚、细胞分化程度越低、伴有淋巴结转移,则α1AT蛋白表达也越低。表明α1AT蛋白表达在NSCLC中高于SCLC,且与病期、分化、淋巴结转移相关;提示α1AT蛋白有可能作为判断肺癌的分期和预后的分子指标。3.α1AT高表达的非小细胞肺癌组织中CD3表达也高,表明α1AT能促进肿瘤部位CD3阳性的肿瘤浸润淋巴细胞数量。提示α1AT蛋白的表达同样是反映肺癌患者机体抗肿瘤免疫状态的指标,有望用于临床指导治疗及判断预后。4.免疫组化结果显示α1AT可上调Fas、FasL表达,下调DcR3的表达。表明α1AT的表达在抑制肺癌细胞的生长,并促进其凋亡中起着重要作用。5.成功构建了α1AT真核表达载体,并成功转染A549细胞,获得高表达α1AT的稳定转染的A549细胞株。为体外研究α1AT对肺癌细胞的影响奠定了基础。6.体外培养状态下,α1AT的过表达明显抑制肺癌细胞A549的增殖、促进癌细胞的凋亡,提示α1AT是一个抑癌因子。7.α1AT在转录和翻译水平上调Fas、FasL的表达,下调DcR3的表达,和免疫组化检测结果相互印证,表明除了其对抗蛋白酶的作用外,α1AT可通过调节相关凋亡因子的表达,抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。这可能是α1AT抑癌作用的一种新的机制。