文蛤（Meretrix meretrix）幼虫生长发育相关基因的克隆和功能分析

论文摘要

贝类养殖是我国海水养殖业中最重要的组成部分之一。贝类人工大规模养殖中的关键环节是种苗的人工繁育,早期幼虫能否正常生长发育,对幼虫变态和变态后生长率及成活率有很大的影响,直接关系到生产产量和经济效益,所以,了解幼虫发育机制对于生产实践具有重要的指导意义。文蛤(Meretrix meretrix)是一种在东亚各国沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类,是我国一种重要的经济品种。本论文以文蛤幼虫为研究对象,分别对文蛤幼虫发育过程中贝壳形成相关的铁蛋白(MmeFer)、营养及变态相关的组织蛋白酶B(MmeCB)及变态过程中细胞凋亡相关的caspase三个基因进行了克隆,分析了基因及编码蛋白在担轮幼虫期(L1)、D形幼虫期(L2)、壳顶幼虫期(L3)和稚贝期(L4)的时空表达特征,解析了其可能的功能,并研究了相应酶类的特异性抑制剂作用对幼虫发育过程的影响,进行了目标蛋白的功能验证,详述如下:研究结果显示,在文蛤胚胎发育到原肠胚时放入不含铁离子的人工海水中培养,发育成无壳的畸形,随着人工海水中铁离子添加浓度的升高,幼虫长出壳状组织接近正常状态;而发育到L1期幼虫放入不含铁离子的人工海水中培养却可以发育出正常的壳,推测铁和铁代谢相关蛋白在幼虫贝壳初始形成有重要的作用。根据构建的文蛤幼虫cDNA文库中提供的序列信息,从文蛤中克隆了与铁离子代谢密切相关的铁蛋白(MmeFer)的全长cDNA序列;通过Real time PCR发现,MmeFer mRNA的表达量在贝壳形成前后有明显改变;整体原位杂交结果显示MmeFer mRNA在L1期的表达部位刚好是贝壳生成的起始部位,推断文蛤铁蛋白与文蛤幼虫贝壳初始形成密切相关。利用文蛤幼虫cDNA文库中的EST信息在幼虫中克隆到文蛤组织蛋白酶B(MmeCB)全长cDNA序列;通过整体原位杂交分析发现MmeCB mRNA在L2至L4期幼虫的消化腺部位表达,而且在L2期的幼虫表皮也有表达,说明MmeCB可能和幼虫消化相关,而且可能参与幼虫从表皮摄取营养的过程。利用MmeCB特异性抑制剂(CA074Me)处理饥饿幼虫,发现其生长受到明显抑制,验证了MmeCB参与幼虫表皮营养代谢的推论。利用免疫组织化学技术,研究了MmeCB蛋白在文蛤幼虫中的时空分布,发现其在L2期幼虫表面和胃部有阳性信号,而在L3期,MmeCB在幼虫面盘基部有强烈的表达,提示MmeCB在文蛤幼虫中不仅起到营养的作用,而且可能和幼虫附着变态有关。利用CA074Me分别处理文蛤胚胎和变态期幼虫,发现抑制MmeCB的活性对胚胎发育和幼虫变态都有显著影响。研究结果提示MmeCB在幼虫发育各阶段均具有重要的生物学功能。根据caspase在不同物种中的保守区域设计简并引物,在文蛤幼虫中扩增到cDNA序列片段;检测有活性的caspase在文蛤幼虫各发育时期的分布部位,发现其在L1至L3期幼虫中都有分布,说明整个幼虫形态变化过程中都有caspase的参与;细胞凋亡检测结果显示,幼虫主要发生细胞凋亡的部位在L3期幼虫的面盘,即变态过程中要退化的器官,说明细胞凋亡可能是文蛤幼虫变态过程中面盘退化的主要机制;用caspase特异性抑制剂处理变态前幼虫,发现幼虫变态率下降,初步验证了caspase在文蛤幼虫变态过程中的作用。通过对上述三种基因的研究,分别探讨了文蛤幼虫发育阶段中的几个主要事件(L1期到L2期的贝壳形成、L2到L3期的幼虫营养摄食及L3到L4期的附着变态)相关的基因及其功能,为研究贝类生长发育调控的分子机理提供了新的线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 海水无脊椎动物幼虫发育
• 1.2.1 幼虫发育的研究
• 1.2.2 贝类发育过程中的形态变化
• 1.2.3 贝类贝壳形成和生长
• 1.2.4 贝类幼虫生长摄食
• 1.2.5 幼虫变态机制的研究
• 1.3 贝类幼虫发育相关基因的研究
• 1.3.1 铁蛋白
• 1.3.2 组织蛋白酶家族
• 1.4 细胞凋亡在发育中的作用
• 1.4.1 细胞凋亡概念的形成
• 1.4.2 细胞凋亡的特点
• 1.4.3 caspase家族
• 1.4.4 细胞凋亡的信号转导途径
• 1.4.5 细胞凋亡的作用
• 1.4.6 caspase抑制剂
• 1.4.7 细胞凋亡的检测方法
• 第2章 文蛤铁蛋白基因的克隆和在幼虫生长发育中的表达分析
• 2.1 材料方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 在不同铁离子浓度下培养幼虫的形态
• 2.2.2 cDNA克隆和序列分析
• 2.2.3 半定量PCR检测MmeFer在不同时期幼虫中的表达量
• 2.2.4 Real time PCR分析文蛤铁蛋白（MmeFer）m RNA在不同幼虫发育时期的表达
• 2.2.5 幼虫发育过程中MmeFer mRNA的空间表达
• 2.2.6 人工海水培养的幼虫中MmeFer mRNA 的空间表达
• 2.3 讨论
• 第3章 文蛤组织蛋白酶B的基因克隆和功能分析
• 第1节 文蛤组织蛋白酶B在幼虫营养中的作用
• 3.1 材料方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 组织蛋白酶B酶基因的克隆和分析
• 3.2.2 MmeCB mRNA在文蛤各个发育时期幼虫中的时空表达
• 3.2.3 组织蛋白酶B特异性抑制剂对饥饿幼虫的影响
• 3.3 讨论
• 第2节 组织蛋白酶B在文蛤幼虫胚胎发育和变态中的功能分析
• 3.4 材料方法
• 3.4.1 实验材料
• 3.4.2 实验步骤
• 3.5 实验结果
• 3.5.1 MmeCB mRNA在幼虫发育过程中表达量的变化
• 3.5.2 MmeCB在不同时期幼虫中的表达部位
• 3.5.3 CA074Me对文蛤幼虫变态的影响
• 3.5.4 CA074Me对文蛤胚胎发育的影响
• 3.6 讨论
• 第4章 细胞凋亡和caspase蛋白酶在文蛤幼虫发育中功能的初步分析
• 4.1 材料方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 文蛤幼虫发育过程中凋亡细胞的分布
• 4.2.2 caspase在不同发育时期幼虫中的分布
• 4.2.3 caspase的抑制剂对变态幼虫的影响
• 4.2.4 caspase基因cDNA片段
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表和完成的文章
• 致谢