烟草中依赖于NAD+的山梨醇脱氢酶基因的克隆及功能的初步研究

论文摘要

在蔷薇科植物中,山梨醇（sorbitol）与其它植物中蔗糖的作用一样,是主要的光合作用产物和同化运输物质。国内外的研究表明,山梨醇能够在转基因植物体内积累并且可以提高植物抗环境胁迫的能力。但也有许多研究发现转基因植物中山梨醇积累过多会抑制植物的生长,甚至使它们发生病变。山梨醇脱氢酶（Sorbitol dehydrogenase, SDH）是山梨醇代谢的关键酶,催化山梨醇转化成果糖的不可逆反应,在调节库容和细胞代谢中具有重要作用。目前山梨醇脱氢酶在蔷薇科果树等木本植物上研究较多,而在其它植物中研究较少,本研究通过对烟草中NAD+依赖的山梨醇脱氢酶基因（命名为:NAD-SDH）的克隆与转基因表达分析,以期为提高农作物的抗逆性研究奠定理论基础。本研究的主要结果如下:1.以珊西烟（Nicotiana tabacum L.cv Xanthi NN）为材料,通过RT-PCR首次克隆了烟草中山梨醇脱氢酶基因（NAD-SDH）,该基因全长1119bp,编码372个氨基酸残基,其氨基酸序列与番茄和葡萄的山梨醇脱氢酶同源性分别为92%和87%。2.构建了原核表达载体pMAL-C2X+NAD-SDH,初步研究分析了烟草中NAD-SDH基因在大肠杆菌中的表达,为进一步蛋白纯化和体外生化实验打下了基础。3.将NAD-SDH cDNA克隆至pSAT6-RFP-N1改造后的瞬时表达载体E3025-GFP中,通过基因枪轰击洋葱表皮细胞对烟草的NAD-SDH进行了亚细胞定位,结果发现细胞膜上有明显绿色荧光,因此推测NAD-SDH基因编码的蛋白存在于细胞膜上。4.筛选出了NAD-SDH基因的T-DNA敲除突变纯合体拟南芥,并进行了抗旱的初步比较实验,发现T-DNA敲除突变纯合体拟南芥与野生型拟南芥相比,其抗旱性有一定程度的提高。此外,构建了pCAMBIA1302+NAD-SDH和pCAMBIA1305.1+ NAD-SDH植物过表达载体,采用农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法,把构建好的植物表达载体转入野生型拟南芥,并分别获得了转基因植株。在转pCAMBIA1302+NAD-SDH重组子的转基因植株与野生型拟南芥进行的抗旱初步比较实验中发现,过表达转基因植株的抗旱性要弱于野生型拟南芥。综上所述,本研究克隆了烟草NAD-SDH基因的全长cDNA序列,发现烟草山梨醇脱氢酶主要分布于细胞膜上,是山梨醇代谢的主要酶,为进一步解析烟草中山梨醇脱氢酶的分子机制以及研究山梨醇在植物体内的功能提供了实验依据和理论基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物中山梨醇的研究
• 1.2 山梨醇在植物中的分布
• 1.3 山梨醇在植物体内的功能
• 1.3.1 是蔷薇科植物主要的光合产物和同化运输物质
• 1.3.2 是蔷薇科植物主要的代谢贮藏物质
• 1.3.3 山梨醇在植物体内的积累可提高植物的抗逆性
• 1.4 山梨醇代谢相关酶的研究进展
• 1.4.1 6-磷酸山梨醇脱氢酶（sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH）
• 1.4.1.1 6-磷酸山梨醇脱氢酶在植物中的研究
• 1.4.1.2 6-磷酸山梨醇脱氢酶的定位
• 1.4.1.3 6-磷酸山梨醇脱氢酶的分布和酶活性变化
• 1.4.1.4 6-磷酸山梨醇脱氢酶的活性、蛋白与转录之间的关系
• 1.4.1.5 6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH）的酶学特征
• 1.4.2 醛糖-6-磷酸还原酶（alditol-6-phosphate reductase,A6PRD）
• 1.4.3 山梨醇-6-磷酸磷酸脂酶（sorbitol-6-phosphate phosphatase,S6PPP）
• 1.4.4 山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase,SDH）
• 1.4.4.1 山梨醇脱氢酶（SDH）的酶学特征
• 1.4.4.2 山梨醇脱氢酶的分布及其活性变化
• 1.4.4.3 山梨醇脱氢酶活性、蛋白与转录之间的关系
• 1.4.5 山梨醇氧化酶（Sorbitol Oxidase,SOX）
• 1.5 S6PDH 与SDH 基因的克隆及其转基因植物的研究进展
• 1.5.1 S6PDH 基因的克隆及同源性分析
• 1.5.2 SDH 基因的克隆及序列分析
• 1.5.3 S6PDH 与SDH 基因的植物遗传转化研究
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 烟草山梨醇脱氢酶基因（NAD-SDH）的克隆与序列分析
• 2.1 植物材料和菌株
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 烟草叶片总RNA 的提取
• 2.2.2 烟草NAD-SDH 全长cDNA 的克隆
• 2.2.2.1 引物设计
• 2.2.2.2 RT-PCR
• 2.2.3 PCR 产物的回收、连接和转化
• 2.2.3.1 PCR 产物的回收
• 2.2.3.2 回收产物与pMD-18 T 载体的连接、转化
• 2.2.4 阳性克隆的筛选鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 烟草NAD-SDH 的克隆
• 2.3.2 烟草NAD-SDH 与其它植物山梨醇脱氢酶氨基酸序列比较
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 NAD-SDH-MBP 融合蛋白的原核表达
• 3.1 菌株和原核表达载体
• 3.2 方法
• 3.2.1 烟草NAD-SDH 编码区cDNA 序列的扩增
• 3.2.2 回收产物NAD-SDH 与pMD-18 T simple 载体的连接、转化和鉴定
• 3.2.2.1 回收产物NAD-SDH 与pMD-18 T simple 载体的连接和转化
• 3.2.2.2 酶切鉴定
• 2X+SDH 的构建'>3.2.3 原核表达载体pMAL-C₂X+SDH 的构建
• 3.2.4 NAD-SDH-MBP 融合蛋白的原核表达
• 3.2.5 SDS- PGAE 电泳
• 3.3 结果与分析
• 2X+SDH 的构建'>3.3.1 原核表达载体pMAL-C₂X+SDH 的构建
• 3.3.2 NAD-SDH-MBP 融合蛋白的原核表达
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 烟草NAD-SDH 蛋白的亚细胞定位
• 4.1 植物材料
• 4.2 瞬时表达载体E3025-GFP 的构建（pSAT6-RFP-N1 载体的改造）
• 4.2.1 瞬时表达载体E3025-GFP 的构建
• 4.2.2 洋葱表皮细胞瞬时表达（基因枪法）
• 4.2.2.1 材料的准备
• 4.2.2.2 金粉悬液的准备
• 4.2.2.3 高纯度大量质粒的提取
• 4.2.2.4 金粉-DNA 复合体的制备
• 4.2.2.5 基因枪法转化E3025-GFP 瞬时表达载体
• 4.2.2.6 GFP 荧光观察
• 4.3 烟草NAD-SDH-GFP 融合蛋白亚细胞定位
• 4.3.1 瞬时表达载体E3025-GFP+NAD-SDH 的构建
• 4.3.2 NAD-SDH-GFP 融合蛋白的亚细胞定位
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 PSATS-RFP-N1 载体的改造
• 4.5.2 利用E3025-GFP 在洋葱表皮细胞瞬时表达GFP
• 4.5.3 烟草NAD-SDH-GFP 融合蛋白亚细胞定位
• 4.6 讨论
• 第五章 拟南芥T-DNA 敲除NAD-SDH 纯合突变体的鉴定
• 5.1 植物材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 拟南芥的种植
• 5.2.2 拟南芥NAD-SDH 基因T-DNA 敲除突变纯合体的鉴定
• 5.2.2.1 植物基因组DNA 的小量提取（SDS 法）
• 5.2.2.2 拟南芥T-DNA 敲除纯合突变体的PCR 鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.4 讨论
• 第六章 NAD-SDH 植物表达载体的构建和转基因拟南芥的获得
• 6.1 材料
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 植物表达载体的构建
• 6.2.2 拟南芥遗传转化
• 6.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 6.2.2.2 重组质粒p1305.1+SDH 和p1302 +SDH 的农杆菌转化
• 6.2.2.3 PCR 验证及菌种保存
• 6.2.2.4 拟南芥遗传转化
• 6.2.3 转基因拟南芥的筛选鉴定
• 0代种子的潮霉素筛选'>6.2.3.1 拟南芥T₀代种子的潮霉素筛选
• 6.2.3.2 转基因拟南芥组织基因组DNA PCR 鉴定
• 6.2.4 转基因拟南芥和T –DNA 敲除NAD-SDH 突变纯合体拟南芥表型观察与初步抗旱试验
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 植物表达载体p1302+SDH 的成功构建
• 6.3.2 植物表达载体p1305.1+SDH 的成功构建
• 6.3.3 重组质粒p1305.1+SDH 和p1302+SDH 的农杆菌转化结果
• 6.3.4 转基因拟南芥的筛选
• 6.3.5 转基因拟南芥的PCR 验证
• 6.3.6 转基因拟南芥和T-DNA 敲除NAD-SDH 突变纯合体拟南芥的表型观察与初步抗旱试验
• 第七章 小结
• 参考文献
• Abstract
• 附录