中国地方绵羊品种PRNP基因研究

论文摘要

绵羊PRNP的多态性与绵羊对痒病的易感性有关,特别是PRNP 136,154和171位点。从我国10省份采集了24个我国主要地方绵羊品种的血液样品668份,提取绵羊基因组DNA,用PCR方法扩增绵羊PRNP基因,通过序列测定,对它们的PRNP基因多态性进行分析,以确定PRNP的多态性情况以及这些绵羊品种对痒病的感染风险。研究发现了PRNP编码区21、85、101、112、127、138、141、143、146、153、154、171和189一共13位点的基因多态性,其中21、85和143位点的多态性为首次发现。值得注意的是,在本次研究中没有发现136位点丙氨酸（A）/缬氨酸（V）的多态性,136位点均为纯合的A。而154位点精氨酸（R）/组氨酸（H）的多态性与先前的研究一致,H的多态性也比较少。在171位点发现了谷氨酰胺（Q）,R,H或赖氨酸（L）四种多态性变化。由于易感等位基因ARQ的等位基因频率高达78.14%,所以调查的羊群对于感染痒病均存在较高的风险。根据绵羊PRNP基因序列设计了针对407、461、512和513位点SNP多态性的上下游引物和探针,建立了检测绵羊PRNP136、154、171位点基因型的TaqMan探针Real-time PCR方法。本方法用于检测绵羊PRNP基因型具有简便快速,结果直观,容易判读等优点,可以用于大量绵羊样品的PRNP基因分型,适合于在大部分具有标准设备的分子生物学实验应用。用本方法检测了200份藏羊的PRNP基因型,结果发现藏羊的PRNP基因型主要为ARQ/ARQ,其次为ARQ/ARR,还有少量的ARQ/VRQ,ARQ/AHQ基因型。根据Genbank中绵羊PrP基因全序列和表达载体pET28a载体和pFMDHZ-α-A的多克隆位点设计了针对绵羊PrP前体蛋白基因引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增绵羊PrP前体蛋白基因,通过酶切、连接,将本基因克隆到原核表达载体pET28a（+）和真核表达载体pFMDHZ-α-A中,构建了重组原核表达载体pET28a-OPrP和真核酵母重组表达载体pFMDHZ-α-A-OPrP。将重组质粒pET28a-OPrP转化E.coli BL-21感受态细胞,用IPTG诱导表达。将重组质粒pFMDHZ-α-A-OPrP经电转化转入多形汉逊酵母中,随后通过甲醇诱导进行表达。通过PAGE电泳和Western-blot鉴定表达的绵羊PrP前体重组蛋白。为TSE的检测及诊断、PrP的结构与功能研究奠定基础。

论文目录

• 本方所用缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节传染性海绵状脑病研究简况
• 1 传染性海绵状脑病简史
• 2 疯牛病概况
• 3 羊痒病
• 4 朊毒体（Prion）的特性
• 5 朊毒体与哺乳动物朊蛋白
• Sc的形成'>6 PrP^Sc的形成
• 7 鱼类PrP 相关蛋白的研究概况
• 8 鱼类其他PrP 相关蛋白的研究
• 9 哺乳动物PrP 和鱼类PrP 相关蛋白的比较
• 第二节 朊蛋白 PRNP 基因多态性与 TSE 的关系
• 1 人的PRNP 基因多态性与人的TSE
• 2 羊的PRNP 基因多态性与羊痒病
• 3 鹿的PRNP 基因多态性与CWD
• 第三节 绵羊 PRNP 基因分型方法研究概况
• 第四节 本课题的立项依据
• 第二章 中国主要地方绵羊品种 PRNP 基因多态性研究
• 第一节 中国主要地方绵羊品种 PRNP 基因多态性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 绵羊样品
• 1.4 绵羊抗凝血样的采集和基因组的提取
• 1.5 PCR 扩增绵羊PRNP 基因
• 1.6 PRNP 基因序列测定
• 2 结果
• 第二节 TaqMan 探针实时荧光 PCR 检测绵羊 PRNP 基因多态性方法的建立及在 PRNP 基因分型中的应用
• 1 材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 绵羊抗凝血样的采集和基因组的提取
• 1.4 引物的设计及探针合成
• 1.5 TaqMan 探针实时荧光PCR 进行SNP 检测的工作原理
• 1.6 DNA、引物及探针用量
• 1.7 荧光定量PCR 检测PRNP 基因多态性反应体系及程序
• 1.8 4074、615、12、513 四个突变位点的SNP 分型参考样本Real-time
• 1.9 TaqMan 探针 Real-time PCR 检测绵羊 PRNP 基因多态性方法的应用
• 2 结果
• 2.1 407 位点定点突变实验报告
• 2.2 407、461、512、513 四个位点Real-time PCR 检测情况
• 2.3 实时荧光定量PCR 检测绵羊PRNP 基因多态性方法的应用
• 3 讨论
• 第三章 绵羊 ARQ 基因型 PrP 前体蛋白基因的克隆及表达
• 第一节 绵羊 ARQ 基因型 PrP 前体蛋白基因的克隆及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 绵羊抗凝血样的采集和基因组的提取
• 1.4 PCR 扩增绵羊PRNP 基因
• 1.5 PrP 基因前体蛋白表达质粒的构建及鉴定
• 1.6 PrP 基因前体蛋白在大肠杆菌中的表达
• 1.7 表达产物的特异性检测
• 2 结果
• 2.1 PCR 扩增绵羊PrP 基因
• 2.2 重组质粒的PCR 鉴定和酶切鉴定
• 2.3 重组质粒的序列测定
• 2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.5 重组蛋白的Western blot 分析
• 3 讨论
• 第二节 绵羊 PrP 前体蛋白基因真核表达载体的构建及汉逊酵母中的初步表达
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 绵羊抗凝血样的采集和基因组的提取
• 1.4 PCR 扩增绵羊PrP 基因
• 1.5 PrP 基因前体蛋白表达质粒的构建及鉴定
• 1.6 PrP 基因前体蛋白在多形汉逊酵母中的表达
• 1.7 表达产物的特异性检测
• 2 结果
• 2.1 PCR 扩增绵羊PrP 基因
• 2.2 重组质粒的PCR 鉴定和酶切鉴定
• 2.3 重组质粒的序列测定
• 2.4 重组蛋白在多形汉逊酵母中的表达和Western blot 分析
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 附1 绵羊PRNP407 位点定点突变实验报告
• 附2 重组质粒pET28a-OPrP 测序结果图
• 附3 重组质粒pGEMT-OPrP 测序结果图
• 附4 溶液配制
• 4.1 多态性研究中的主要试剂配制
• 4.2 原核表达中主要试剂的配制
• 4.3 酵母表达中主要试剂的配制
• 致谢
• 发表论文情况