文昌鱼微卫星标记的筛选及其遗传多样性与保护策略的研究

论文摘要

文昌鱼（Amphioxus）是在进化地位上处于无脊椎动物与脊柱动物之间的中间过渡物种，是新兴的模式动物之一。厦门刘五店曾是世界上著名的具有渔业捕捞价值的文昌鱼产地，但是由于生境破坏、环境污染和捕捞过度的原因，文昌鱼的资源量急剧下降，已被列为国家二级保护动物。为了给厦门文昌鱼（Branchiostoma belcheri Gray）的遗传保护提供分子水平上的理论依据，本研究运用微卫星标记技术和mtDNA12S rRNA、COII、COIII标记技术分析文昌鱼基因频率的分布、遗传多样性、遗传分化等群体遗传学方面的内容。同时，根据以上分析确定文昌鱼的进化显著单元（ESU）和管理单元（MU），进一步完善文昌鱼在保护遗传学方面的研究，以期为厦门文昌鱼保护策略的制定提供依据和建议。本研究采用FIASCO法筛选出了8对文昌鱼微卫星多态性引物，并对文昌鱼4个群体（大嶝岛水域群体、南线至十八线东端群体、南线至十八线西端群体、黄厝水域群体）的遗传多样性和遗传分化进行了分析；运用mtDNA12S rRNA、COII、COIII标记，分析了文昌鱼4个群体的序列特征、群体遗传多样性和遗传变异，并进行了分子中性进化检验。（1）采用FIASCO法，利用bio-（GT）15、bio-（CT）15的混合探针构建文昌鱼（CA）n、（GA）n微卫星文库。挑取100个片段长度为300-1200bp的克隆振荡培养并测序，经过序列筛选，设计了41对微卫星引物。以30个文昌鱼个体对多态性微卫星位点进行评价，共检测出8对多态性引物，其等位基因数为3-10个，多态信息含量（PIC）为0.279-0.847，观察杂合度为0.1667-0.9333，期望杂合度为0.3100-0.8617。位点多态性分析结果显示，除位点Brb8（PIC：0.347）、Brb90（PIC：0.279）为中度多态外，其余6个位点均大于0.56，具有高度多态性，适合进行种群遗传学研究。（2）利用自行筛选的8对微卫星引物和援引3对青岛文昌鱼引物，对4个文昌鱼群体的遗传结构进行研究，分析了各群体内的遗传多样性和群体间的遗传分化。文昌鱼4个群体的平均每位点等位基因数（A）介于4.6364-5.4545之间，平均为5.0682；平均每位点有效等位基因数（Ae）介于2.3138-2.8661之间，平均为2.5111；观察杂合度在0.3966-0.4839之间，平均为0.4497；期望杂合度在0.5045-0.5699之间，平均为0.5315，多态信息含量介于0.4587-0.5404之间，平均为0.4936。在总体水平上，文昌鱼的平均每位点等位基因数（A）、平均每位点有效等位基因数（Ae）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）分别为6.3636、2.6405、0.4494、0.5493。文昌鱼4个群体间的遗传距离（D）介于0.0388-0.0709之间，平均为0.0522；遗传相似度介于0.9315-0.9619之间，平均为0.9492。4个群体的群体间的遗传分化系数（FST）为0.0329，基因流（Nm）为7.3448。聚类分析显示，南线至十八线东端群体和大嶝岛水域群体亲缘关系较近，聚为一支；南线至十八线西端群体和黄厝水域群体亲缘关系较近，聚为一支。（3）mtDNA12S rRNA研究结果认为，四个文昌鱼群体的23个个体中共发现30个变异位点，其中包含3个碱基插入/缺失位点和27个多态位点，共定义了23种单倍型。23个个体的平均核苷酸差异数为3.285，核苷酸多样性指数为0.00515。在群体水平上，平均核苷酸差异数介于2.600-3.733，核苷酸多样性指数介于0.00408-0.00585，单倍型多样性指数均为1.000。文昌鱼4个群体间的遗传距离为0.0042-0.0049，平均为0.0046。分子变异AMOVA分析显示，文昌鱼群体之间无显著的遗传分化。Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验均表明文昌鱼群体极显著地偏离中性。（4）mtDNACOII研究结果认为，四个文昌鱼群体的22个个体中共发现39个多态位点，包括38个碱基转换位点和1个碱基颠换位点，共定义了21种单倍型。22个个体的平均核苷酸差异数为5.745，核苷酸多样性指数为0.00831，单倍型多样性指数为0.996。在群体水平上，平均核苷酸差异数介于4.133-7.500，核苷酸多样性指数介于0.00598-0.01085，单倍型多样性指数为1.000。文昌鱼4个群体间的遗传距离为0.0067-0.0106，平均为0.0084。分子变异AMOVA分析显示，文昌鱼群体之间无显著的遗传分化。Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验均表明文昌鱼群体显著地偏离中性。（5）mtDNA COIII研究结果认为，四个文昌鱼群体的23个个体中共发现56个多态位点，包括52个碱基转换位点和4个碱基颠换位点，共定义了22种单倍型。23个个体的平均核苷酸差异数为6.656，核苷酸多样性指数为0.00844，单倍型多样性指数为0.996。在群体水平上，平均核苷酸差异数介于3.867-9.733，核苷酸多样性指数介于0.00490-0.01234，单倍型多样性指数均为1.000。文昌鱼4个群体间的遗传距离为0.0062-0.0110，平均为0.0085。分子变异AMOVA分析显示，文昌鱼群体之间无显著的遗传分化。Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验均表明文昌鱼群体显著地偏离中性。结合以上四项技术分析结果认为，文昌鱼的遗传多样性水平处在中等水平，并未出现明显的遗传分化。应及时保护文昌鱼群体的遗传多样性。本研究综合文昌鱼的遗传结构分析、资源状况和栖息地环境等方面，提出了六项文昌鱼资源保护策略，并建议将大嶝岛附近的海域纳入现有的文昌鱼保护区。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 文昌鱼的生物学特征概况
• 1.2 群体遗传学的研究方法
• 1.2.1 等位酶技术简介
• 1.2.2 RAPD 技术简介
• 1.2.3 AFLP 技术简介
• 1.2.4 微卫星标记技术简介
• 1.2.5 RFLP 技术简介
• 1.2.6 线粒体 DNA 标记技术简介
• 1.3 群体遗传学研究方法在其他濒危动物中的应用
• 1.3.1 等位酶技术在其他濒危动物中的应用
• 1.3.2 RAPD 技术在其他濒危动物中的应用
• 1.3.3 AFLP 技术在其他濒危动物中的应用
• 1.3.4 微卫星标记技术在其他濒危动物中的应用
• 1.3.5 RFLP 技术在其他濒危动物中的应用
• 1.3.6 线粒体 DNA 标记技术在其他濒危动物中的应用
• 1.4 文昌鱼的群体遗传学研究现状
• 1.4.1 等位酶技术
• 1.4.2 RAPD 技术
• 1.4.3 AFLP 技术
• 1.4.4 微卫星标记技术
• 1.4.5 线粒体 DNA 标记技术
• 1.4.6 DNA 测序技术
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第2章 文昌鱼群体遗传学研究的方案
• 2.1 样本采集
• 2.2 研究内容
• 2.3 技术路线
• 第3章 文昌鱼微卫星分子标记的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要仪器与试剂
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 基因组 DNA 抽提结果
• 3.2.2 基因组 DNA 酶切结果
• 3.2.3 目的片段 PCR 扩增结果
• 3.2.4 阳性克隆检测结果
• 3.2.5 测序结果及引物设计
• 3.2.6 微卫星多态性检测结果
• 3.3 讨论
• 第4章 文昌鱼的群体遗传结构研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要仪器与试剂
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 厦门文昌鱼微卫星的扩增
• 4.2.2 厦门文昌鱼群体的杂合性
• 4.2.3 等位基因频率的分布
• 4.2.4 厦门文昌鱼群体的遗传多样性
• 4.2.5 厦门文昌鱼群体间的遗传分化
• 4.3 讨论
• 4.3.1 种间微卫星引物的适用性分析
• 4.3.2 厦门文昌鱼群体的杂合性分析
• 4.3.3 厦门文昌鱼群体的遗传多样性分析
• 4.3.4 厦门文昌鱼群体间的遗传分化
• 第5章 文昌鱼群体线粒体 12S rRNA、COII 和 COIII 基因序列的比较研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 主要仪器与试剂
• 5.1.3 实验方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 线粒体 12S rRNA 基因片段分析结果
• 5.2.2 线粒体 COII 基因全序列分析结果
• 5.2.3 线粒体 COIII 基因全序列分析结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 文昌鱼线粒体 12S rRNA 基因分析
• 5.3.2 线粒体 COII、COIII 基因分析
• 第6章 厦门文昌鱼的保护策略
• 6.1 厦门文昌鱼的资源状况
• 6.2 优先保护种群的确定
• 6.3 厦门文昌鱼的保护策略
• 第7章 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 在学期间发表的学术论文