口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因在昆虫细胞中的表达与活性检测

论文摘要

本研究通过杆状病毒表达系统分泌表达了口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth DisaseVirus，FMDV）非结构蛋白（Non-structural protein，NSP）3ABC，用亲和层析方法纯化，获得了高纯度的重组3ABC蛋白抗原，并且进行了重组蛋白的生物活性分析，初步建立了一种检测FMDV NSP抗体的间接ELISA方法。该研究为制备接近天然的FMDV NSP 3ABC抗原提供了一种方法，并且初步建立了一种敏感和特异更高的FMDV感染动物与免疫动物鉴别诊断方法。用PCR技术扩增出O型China／99株FMDV 3ABC基因，首先克隆到pGEM-Teasy载体，再亚克隆到含有一段蜂毒溶血肽序列的转座载体pMelBac B中，构建出穿梭载体pMel-3ABC。最后将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫细胞Sf9，通过噬斑筛选和PCR鉴定，获得了重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以MOI 10感染Sf9细胞，接种病毒71 h时收获细胞培养基上清，样品经SDS-PAGE和Western blowing证实3ABC蛋白获得了分泌性表达，分子量约48ku，与预测蛋白大小一致，表达量占细胞分泌总体蛋白的80％，浓度高达2.076mg／mL，而且与FMDV感染血清有良好的反应活性。对接种重组杆状病毒71 h后收获的Sf9细胞培养基上清通过亲和层析法纯化重组蛋白。用纯化的重组3ABC蛋白作为抗原包被酶标板，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗猪IgG和兔抗羊IgG为二抗，建立了检测FMDV抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：包被条件为37℃放置1h加4℃过夜；FMD动物阳性血清（1∶20稀释）在37℃作用45 min，酶标二抗（1∶30000）在37℃作用45 min；底物溶液37℃显色15 min。通过反应活性测定、特异性试验和对比实验表明该法具有很高的特异性和敏感性。通过进一步与本实验室研制的以大肠杆菌表达物为抗原的FMDV NSP抗体检测试剂盒对田间采集猪、羊血清进行检测比较，发现两者的符合率为90％。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略表
• 第一部分 文献综述
• 1 口蹄疫研究进展
• 1.1 口蹄疫
• 1.2 口蹄疫病原
• 1.3 FMD的危害
• 1.4 FMDV感染动物和免疫动物的区分
• 1.5 口蹄疫的诊断与防制
• 1.6 口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因及其功能
• 2 杆状病毒表达系统
• 2.1 杆状病毒的特性
• 2.2 杆状病毒表达系统的组成
• 2.3 杆状病毒表达系统的优点
• 第二部分 研究报告
• 第一章 口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达与重组蛋白的纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 细胞和病毒
• 1.4 主要仪器
• 1.5 设计合成引物
• 1.6 3ABC基因的获得
• 1.7 克隆载体的构建
• 1.8 重组穿梭载体的构建
• 1.9 重组穿梭质粒序列测定
• 1.10 重组杆状病毒的构建
• 1.1 重组病毒滴度测定
• 1.12 重组蛋白的表达
• 1.13 重组蛋白的纯化
• 2 结果
• 2.1 3ABC基因片段的PCR扩增
• 2.2 重组克隆载体的鉴定
• 2.3 重组穿梭载体的鉴定
• 2.4 重组杆状病毒的筛选与鉴定
• 2.5 重组杆状病毒噬斑分析
• 2.6 重组杆状病毒MOI值和最佳表达时间的测定
• 2.7 表达产物的纯化以及SDS-PAGE和Western blot检测
• 3 讨论
• 3.1 杆状病毒表达系统
• 3.2 重组杆状病毒的获得
• 3.3 重组蛋白分泌性表达条件
• 3.4 重组蛋白的纯化
• 第二章 检测猪、羊口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA模型的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 抗原
• 1.2 主要试剂和材料
• 1.3 溶液的配制
• 1.4 间接ELISA检测方法初步模型的建立
• 1.5 反应活性测定
• 1.6 特异性试验
• 1.7 对比试验
• 1.8 田间血清样品的检测
• 2 结果
• 2.1 间接ELISA方法最佳工作条件的确定
• 2.2 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 2.3 抗原反应活性测定
• 2.4 ELISA特异性试验
• 2.5 对比试验
• 2.6 田间血清样品的检测
• 3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介