论文摘要
蛋白水解酶（proteolytic enzyme）有时也称为蛋白酶（protease）,是指用于切断蛋白质分子内部肽键,使蛋白质分子变成小分子多肽或氨基酸的内切（肽）酶,蛋白水解酶在工农业和医药生产上有着广泛的应用,是目前医药行业中应用最广的一类酶.金属蛋白酶（Metalloprotease）是活性中心依赖于金属离子的一类蛋白酶。大多数金属蛋白酶是Zn2+金属蛋白酶,金属蛋白酶分布广泛,性质特异,具有重要的应用价值.目前主要应用于食品、洗涤剂、化妆品、杀虫剂及抗肿瘤药物的开发和疾病的机理研究等方面.由于金属蛋白酶来源有限,限制了金属蛋白酶的进一步发展,所以研究微生物金属蛋白酶,利用微生物发酵生产金属蛋白酶具有重大的现实意义.嗜线虫沙雷氏茵（Serratia nematodiphila）是本试验室从昆虫病原线虫崇明拟异小杆线虫（Heterorhabditidoides chongmingensis）的肠道中分离到的1个昆虫病原线虫共生菌新种.本试验从Serratia nematodiphila的DZ0503SB1的菌体发酵液中分离纯化得到一种金属蛋白酶,属于锌离子金属蛋白酶.经Sephadex G-75凝胶过滤、DEAE-Sepharcyl Fast Flow离子交换层析、Resource Q中压液相层析分离得到电泳纯的蛋白.通过还原与非还原SDS-PAGE电泳表明该蛋白为单链分子,相对分子质量约为50 kDa。该菌能在以酪蛋白为底物的蛋白酶检测固体培养基上形成明显的水解晕圈,证明该菌株具有较强的蛋白酶水解酶活力.通过酶活性检测结果表明,纯化的蛋白具有酪蛋白水解酶活性.同时,通过分析用Edman降解法得到的N-端15个氨基酸序列,发现与来源于粘质沙雷氏茵Serratia marcescens SM6和粘质沙雷氏茵Serratiamarcescens E15以及粘质沙雷氏茵Serratia marcescens HR-3的金属蛋白酶N-端15个氨基酸序列具有较高的相似性,进一步证明了该蛋白是金属蛋白酶.根据N-端测序结果和同源性分析设计了一对引物,采用PCR技术扩增得到1500bp左右的产物,然后插入到PMD18-T载体中并转化到大肠杆菌中,对得到的阳性克隆测序。测序结果显示,该片段长1398bp,编码465个氨基酸残基.分析发现克隆翻译得到氨基酸序列与N-末端测序结果相吻合,得到一个完整的成熟肽序列.该基因序列与报道的粘质沙雷氏菌SM6菌株的金属蛋白酶基因的同源性达到98%,与沙雷氏菌HR-3菌株金属蛋白酶基因的的同源性也达到97%,推导的成熟肽氨基酸序列与粘质沙雷氏菌SM6菌株和沙雷氏菌HR-3菌株的金属蛋白酶成熟肽同源性都达到98%。该成熟肽片段包括470个氨基酸残基,预测等电点为pI4.57,相对分子质量为50642.92Da.通过研究证实:该菌株在LB培养基和加有酪蛋白的基础盐培养基中分泌的胞外蛋白酶活力在对数期随着细菌浓度的增大不断增强,在对数生长末期约30 h蛋白酶活性达到最大,而该菌株在无蛋白质和氨基酸的基础盐培养基中培养50 h都未检测到胞外蛋白酶活性物质。通过Serratia nematodiphila在不同培养条件下生长与产酶的比较确定该菌株分泌的胞外蛋白酶为诱导型表达。本实验在证明了该蛋白是金属蛋白酶的基础上,进一步研究了纯化的金属蛋白酶的一些酶学性质。动力学方法测得该金属蛋白酶能适应较宽的pH值范围,该酶在6.0-11.0的pH值范围内稳定,最适pH值为8.0,该酶在43℃以下的温度范围内稳定,最适温度35℃。以酪蛋白为底物的Km值为6.10 mg/mL.该酶对各种有机溶剂都有较强的耐受性,但甲醛对酶活性的影响较大,对非离子表面活性剂敏感。Zn2+、Cu2+离子对酶活力有不同程度的抑制作用;Ni2+,Mg2+,Co2+,Ba2+,Fe3+等金属离子在低浓度时对酶的活性有不同程度的促进作用。相对看来各种浓度的Mg2+、Ca2+和Fe2+对酶活力的影响较小,高浓度时各种离子对酶的活力都有抑制作用.20 mM的金属离子螯合剂EDTA和3 mM 1,10邻氮二菲都对蛋白酶活力有较大程度的抑制作用（抑制50%以上）,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mn2+,Ni2+,Mg2+等离子对EDTA抑制了的酶活力有不同程度的恢复作用,尤其是Mg2+使被EDTA抑制了的酶活力恢复了84.2%,Ca2+,Cu2+,Co2+,Mg2+,Zn2+,Mn2+,Ni2+,Fe2+,Fe3+等离子对1,10邻氮二菲抑制了的酶活力有不同程度的恢复作用,尤其是Fe2+使酶活力恢复了74.5%。这说明金属离子对于维持该酶结构的稳定性,进而保持其酶活力起了非常重要的作用,可以确定该酶为金属蛋白酶。