论文摘要
目的:对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUMSCs）的生物学特性进行鉴定,并探讨hUMSCs移植对大鼠缺血性脑卒中的作用和作用机制,为hUMSCs在神经科学领域的临床应用提供理论依据和实验基础。方法:取足月妊娠剖宫产健康新生儿的脐带,以D-Hank’s充分冲洗,剔除脐动脉和脐静脉,将剩余的脐带间质组织切割成1 mm3大小的组织块,0.2%胶原酶II消化,在含有20%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、2 ng/mL表皮细胞生长因子（epidermal growth factor, EGF）、25 mM左旋谷氨酰胺（L-glutamine, L-Glu）、100 U/mL青霉素,100μg/mL链霉素的DMEM/F12中培养。观察原代培养细胞的形态学变化,当细胞达80%90%汇合时,加入0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化细胞,并传代。收集消化后的细胞,以流式细胞法行细胞表型检测,包括PE-CD13,PE-CD29,PE-CD31,PE-CD44,PE-CD73,PE-CD105,PE-CD133,PE-CD166,FITC-CD34,FITC-CD45,FITC-CD90 , FITC-HLA-ABC （HLA-I）和FITC-HLA-DR （HLA-II）,并以FITC或PE标记的小鼠IgG1作为同型对照。选取体重在230250 g之间的成年雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠为实验动物。将直径0.235 mm、头端以石蜡包裹的尼龙丝线经右侧颈总动脉插入颈内动脉（丝线头端刚好阻断大脑中动脉起始部为宜）,造成大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）。栓塞2 h后再次麻醉动物,回撤栓线使血流再灌注。24 h后应用改良神经功能评分（modified neurological severity score, mNSS）对实验动物神经功能进行评价。选评分在712分的大鼠随机分为三组:（1）hUMSCs移植组,n=12;（2）磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline,PBS）对照组,n=12;（3）MCAO模型组,n=8。另外设（4）假手术组,n=4。将大鼠再次麻醉,头部固定于立体定向架上。用10μL的Hamilton注射器,将1,1’-双十八烷-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐（ 1,1’ - dioctadecyl - 3,3,3’,3’ - tetramethylindocarbocyanine perchlorate , DiI ）标记过的hUMSCs缓慢注射到hUMSCs移植组、假手术组大鼠的右侧纹状体区（AP=-1.0 mm;ML=2.0 mm;DV=4.5 mm）和大脑皮层（AP=-1.0 mm;ML=2.0 mm;DV=2.0 mm）。每只大鼠接受10μL注射,约5×105细胞,其中纹状体区7μL,大脑皮层3μL。拔针后用医用生物蛋白胶将针孔和骨孔封闭。PBS对照组依同样方法注入等量的PBS。在MCAO前和MCAO后1、7、14、21、28 d对所有大鼠进行mNSS评价;MCAO后2428 d采用Morris水迷宫实验（Morris water maze,MWM）评估各组实验动物的空间学习能力。测试结束后,将大鼠处死迅速取出全脑连续冰冻切片,免疫荧光染色检测DiI的标记hUMSCs在缺血脑组织中存活和神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）、微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2,MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、血小板内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1,CD31）以及血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）的情况。采用SPSS 15. 0 for Windows统计学软件对实验数据进行统计分析。结果:细胞接种后2448 h即可见有少量形态各异的贴壁细胞,610 d以后见成纤维细胞样克隆形成,克隆呈放射状生长。在接种2w时,细胞达到80%90%汇合程度;经消化后按1:21:3的比例将细胞传代。传代后数小时内可见其迅速贴壁,56d后达到90%95%汇合程度,低倍镜下细胞呈排列紧密的漩涡样结构。流式细胞检测显示这些细胞表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和CD166,不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133。对组织相容性免疫表型的分析显示hUMSCs不表达HLA-DR （HLA-II）抗原,而表达HLA-ABC （HLA-I）抗原。MCAO前和MCAO后24 h,hUMSCs移植组、PBS对照组、MCAO模型组大鼠的mNSS评分之间均没有显著性差异（P>0.05）。MCAO 14 d以后hUMSCs移植组大鼠在mNSS评分上较对照组有明显的改善（p<0.05）。在Morris水迷宫的测试中hUMSCs移植组大鼠的平均逃避潜伏期也明显短于对照组。免疫荧光染色证明,hUMSCs移植后28 d不但可以有一定数量的hUMSCs在宿主脑内存活,并且其中的一部分细胞可以表达NSE、MAP2、GFAP、CD31和vWF抗原。结论:本研究证实了人脐带富含MSCs,可在体外进行分离、培养、扩增传代。并且移植后可在宿主脑内存活、分化,促进MCAO大鼠的神经功能恢复。