论文题目: 猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 徐高原
导师: 陈焕春,熊远著
关键词: 乙型脑炎病毒,伪狂犬病病毒,克隆,表达,基因,基因,重组病毒
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)和伪狂犬病(Pseudorabies)均是危害养猪业的重大疫病,主要引起种猪繁殖障碍,给养猪业造成了巨大的经济损失。同时乙型脑炎还是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一,对人类危害巨大。猪是乙型脑炎病毒的主要扩增宿主和传染源,因此控制猪的乙型脑炎不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。目前免疫接种仍是预防和控制这两种传染病最有效的措施,而现有乙型脑炎疫苗,无论是灭活疫苗还是弱毒活疫苗都存在一定的缺陷。鉴于此,本研究从乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株中扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1;实现了E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达;构建了表达乙型脑炎病毒主要免疫原性基因E或NS1的重组伪狂犬病病毒,并对所构建的重组伪狂犬病病毒的生物学特性、安全性及免疫原进行了研究。其具体研究内容包括: 1.乙型脑炎病毒E和E-NS1基因的克隆与序列分析 根据已报道的乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列,设计了2对引物,采用一步法RT-PCR扩增了其主要免疫原性基因E和E-NS1,并进行了克隆与序列测定。结果发现,与已报道的SA14-14-2疫苗株核苷酸序列比较,E基因的同源性为100%,E-NS1基因片段发生了3个核苷酸的改变,即1596 g-a、2639 t-c、2817 g-a,并导致了2个氨基酸的改变,即E207 G-R,NS114 G-S,而2639 t-c为无义突变。 2.E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的高效表达 将E基因RT-PCR产物克隆到pBlusecriptⅡSK(+)载体中,然后分别亚克隆到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体pcDNA3.1+中,筛选重组质粒,分别命名为pKG-E和pcDNA3.1E。pKG-E转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为83KD,主要以包涵体形式存在,Western blot分析证实表达产物具有良好的生物学活性。pcDNA3.1E采用脂质体法转染BHK-21细胞,48小时后收集转染的细胞处理后,进行SDS-PAGE电泳,经Western blot分析,在53KD处出现特异性反应带,而对照未出现特异性反应带,证实E基因在哺乳动物细胞中获得表达。 3.表达乙型脑炎病毒E或NSl蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建 设计1对引物从质粒pTNSl上扩增NSl基因,双酶切后将NSl基因定向插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体pgG-Uni中,得到重组转移载体pgG-NSl:用BamHl和EcoRI酶切pSK-E,回收E基因后与经相同酶切的载体pgG-Uni相连,得到重组转移载体pgG-E。将重组转移载体用KpnI线性化后分别与经EcoRI酶切消化的PRV Ea TK~-/gG~-/LacZ~+突变株基因组DNA共转染PK-15细胞,经空斑筛选纯化、PCR、Southern印迹、Western blot等鉴定,获得了2株纯化的重组病毒,分别命名为TK~-/gG~-/NS1~+和TK~-/gG~-/E~+。重组病毒部分生物学特性研究表明:本研究构建的2株重组病毒遗传稳定性良好:外源基因的插入不影响伪狂犬病病毒在细胞
论文目录:
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1．1 伪狂犬病病毒及其分子生物学慨述
1．2 活病毒载体研究进展
1．3 乙型脑炎及其危害
1．4 乙脑病毒的特性
1．5 乙脑病毒分子生物学研究进展
1．6 乙脑诊断方法研究概述
1．7 乙脑疫苗研究进展
第2章 研究目的意义
第3章 材料与方法
3．1 实验材料
3．2 实验方法
3．2．1 病毒的增殖
3．2．2 病毒基因组的提取
3．2．3 RT-PCR扩增与检测
3．2．4 RT-PCR产物的回收与纯化
3．2．5 连接反应
3．2．6 大肠杆菌感受态细胞的制备
3．2．7 连接产物的转化
3．2．8 质粒的制备
3．2．9 质粒转染和表达细胞系的建立
3．2．10 诱导表达
3．2．11 JEV E、NS1、E-NS1基因的PCR扩增
3．2．12 重组转移载体的构建
3．2．13 脂质体介导的共转染
3．2．14 重组病毒的空斑筛选
3．2．15 重组病毒的空斑纯化与PCR鉴定
3．2．16 SDS-PAGE电泳
3．2．17 Western blot
3．2．18 Southern杂交
3．2．19 动物试验用疫苗的制备
3．2．20 动物试验
3．2．21 微量中和试验
3．2．22 ELISA检侧
3．2．23 细胞免疫的检测
3．2．24 统计方法
第4章 结果与分析
4．1 乙脑病毒SA14-14-2株E及E-NS1基因的克隆及序列分析
4．1．1 JEV E和E-NS1基因cDNA的扩增与克隆
4．1．2 E和E-NS1基因的核苷酸序列测定及分析
4．2 乙脑病毒E基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达
4．2．1 GST-E融合的原核表达质粒的构建与酶切鉴定
4．2．2 GST-E在大肠杆菌中的融合表达
4．2．3 原核表达产物Western blot检测
4．2．4 E基因重组真核表达质粒的构建与酶切鉴定
4．2．5 E基因在哺乳动物细胞中的表达
4．3 重组伪狂犬病毒TK~-/gG~-/NS1~+的构建
4．3．1 含NS1基因的转移质粒的构建
4．3．2 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+的筛选与纯化
4．3．3 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+的PCR鉴定
4．3．4 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+的Southern杂交鉴定
4．3．5 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+表达的NS1蛋白抗原性测定
4．3．6 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+在不同细胞上的增殖滴度
4．3．7 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+的遗传稳定性
4．3．8 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+二价基因工程疫苗的制备
4．3．9 重组病毒TK~-/gG~-/NS1~+的动物试验
4．4 重组伪狂犬病毒TK~-/gG~-/NS1~+的构建
4．4．1 含E基因的转移质粒的构建
4．4．2 重组病毒TK~-/gG~-/E~+的筛选与纯化
4．4．3 重组病毒TK~-/gG~-/E~+的Southern杂交鉴定
4．4．4 重组病毒TK~-/gG~-/E~+的Western blot鉴定
4．4．5 重组病毒TK~-/gG~-/E~+在不同细胞上的增殖滴度
4．4．6 重组病毒TK~-/gG~-/E~+的遗传稳定性
4．4．7 重组病毒TK~-/gG~-/E~+二价基因工程疫苗的制备
4．4．8 重组病毒TK~-/gG~-/E~+的动物试验
第5章 讨论与结论
5．1 讨论
5．1．1 乙脑病毒E及E-NS1基因的克隆
5．1．2 乙脑病毒SA14-14-2株E基因的稳定性
5．1．3 E基因在体外的高效表达
5．1．4 载体病毒株的选择
5．1．5 表达乙脑病毒NS1或E蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建
5．1．6 重组伪狂犬病病毒的生物学特性和安全性
5．1．7 表达乙脑病毒NS1或E蛋白的重组伪狂犬病病毒的免疫反应
5．2 结论
参考文献
缩略词(Abbreviation)
附录
致谢
发布时间: 2005-12-05
参考文献
- [1].猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D]. 李自力.华中农业大学2004
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