亚麻（Linum usitatissimum L.）EST-SSR标记开发及遗传图谱构建

论文摘要

亚麻（Linum usitatissimum L.）作为一种优质的纤维作物和油料作物,在工农业领域具有重要的经济价值。基于EST序列开发的SSR标记由于源自编码区,可直接用于基因作图和基因发掘,并且具有信息量大、通用性好、开发简单等优越性,是目前一种主要的功能性分子标记。目前EST-SSR分子标记在不同物种的遗传连锁图谱构建、比较作图、种质资源遗传多样性评价、亲缘关系鉴定、引物通用性研究等方面得到广泛应用。但已公布的亚麻EST-SSR标记数目较少,远不能满足研究需要,所以开发新的亚麻EST-SSR引物,增加可用亚麻分子标记数量成为亟待解决问题,构建亚麻遗传图谱将对亚麻遗传多样性分析、种质资源鉴定、基因定位、分子标记辅助育种以及基因克隆研究具有重要意义,也将为其他麻类作物的遗传图谱构建提供理论依据。本研究利用从NCBI公共数据库下载的EST序列中进行了SSR的查找和分析,估测了亚麻EST-SSR分子标记出现的频率和分布特征。并根据EST序列中SSR位点两端的保守序列设计引物,通过在20份亚麻材料中进行多态性检测,开发出稳定可用的亚麻EST-SSR分子标记,并且利用EST-SSR分子标记的遗传多样性分析对20份亚麻材料进行亲缘关系鉴定。同时选取20份材料中的一个油用材料CN98816和纤用材料Opaline为亲本建立F2作图群体,通过EST-SSR分析初步构建遗传连锁图谱。本研究建立了一套可行的亚麻EST-SSR开发、遗传图谱构建体系,主要结果如下:1.成功的设计EST-SSR引物并开发出EST-SSR标记。本研究从公共数据库中下载了7947条亚麻EST序列,利用SSRIT软件检索出其中有239条序列含有SSR。共设计了100对EST-SSR引物,选取评分在95分以上引物65对,利用20份性状各异的亚麻品种进行多态性筛选,其中32对扩增条带清晰且具有多态性可作为EST-SSR分子标记。2.优化了亚麻EST-SSR PCR反应体系。对体系中的四种主要成分Mg2+、dNTP、引物、Taq聚合酶浓度分别进行单因素实验,确定亚麻EST-SSR PCR反应最优体系（20μL）为:1×PCR缓冲液,50ng模板DNA,Mg2+浓度1.25mmol/L,dNTP浓度0.125mmol/L,引物浓度0.500mmol/L,Taq聚合酶1U。3.通过EST-SSR分子标记遗传多样性分析鉴定20份亚麻材料的亲缘关系。通过聚类分析可将20份亚麻材料划分为五大类,且准确的从亲缘关系上区分油用品种和纤维用品种。4.构建了亚麻遗传图谱。该图谱包括3个连锁群,由13个EST-SSR分子标记组成,覆盖基因组长度43.4cM,平均图距3.3cM。验证了EST-SSR分子标记用于遗传图谱构建的可行性。5.利用NCBI的BLAST程序对定位在亚麻遗传图谱中的分子标记所对应的EST序列进行同源性比对分析,有9条EST序列与具有生物功能的核酸或蛋白质同源,从而推测其可能具有的生物功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 本研究的目的与意义
• 1.2 分子标记概述
• 1.2.1 遗传标记的类型及特点
• 1.2.2 分子标记的类型及发展过程
• 1.3 简单重复序列（SSR）分子标记
• 1.3.1 简单重复序列（SSR）
• 1.3.2 SSR 分子标记原理及特点
• 1.3.3 SSR 分子标记发展过程
• 1.4 EST-SSR 标记开发
• 1.4.1 表达序列标签EST （expressed sequence tags）
• 1.4.2 EST 分子标记的类型及特点
• 1.4.3 EST-SSR 分子标记开发策略
• 1.4.4 EST-SSR 标记的应用现状
• 1.5 遗传图谱构建
• 1.6 亚麻分子标记技术研究现状
• 1.6.1 种质资源遗传多态性和亲缘关系方面研究进展
• 1.6.2 遗传图谱构建研究方面进展
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 EST 序列来源
• 2.1.2 EST-SSR 标记开发试验材料
• 2.1.3 构建遗传图谱材料
• 2.2 试验仪器与试剂
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 EST-SSR 引物设计
• 2.3.2 总DNA 提取方法
• 2.3.3 模板DNA 质量检测
• 2.3.4 SSR-PCR 体系优化
• 2.3.5 EST-SSR 标记结果的电泳检测
• 2.3.6 用于遗传图谱构建EST-SSR 引物选择
• 2.4 数据处理
• 2.4.1 20 份亚麻EST-SSR 聚类分析
• 2.4.2 遗传连锁图谱构建数据统计分析
• 2.4.3 EST 序列功能预测与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 亚麻EST 序列中SSR 分布特点
• 2 群体材料农艺性状调查结果'>3.2 F₂群体材料农艺性状调查结果
• 3.3 亚麻DNA 质量检验结果
• 3.4 亚麻EST-SSR 反应体系优化
• 2+浓度对 SSR 扩增结果的影响'>3.4.1 Mg²⁺浓度对 SSR 扩增结果的影响
• 3.4.2 dNTP 浓度对SSR 扩增结果的影响
• 3.4.3 引物浓度对SSR 扩增结果的影响
• 3.4.4 Taq 酶用量对SSR 扩增结果的影响
• 3.5 EST-SSR 引物在20 份亚麻材料上多态性筛选结果
• 3.6 20 份亚麻材料聚类分析结果
• 3.7 构建遗传图谱特异性引物筛选结果
• 3.8 亚麻遗传图谱构建
• 3.9 EST 序列功能分析结果
• 4 讨论
• 4.1 亚麻EST-SSR 标记开发
• 4.2 亚麻EST-SSR 分子标记应用
• 4.2.1 遗传多样性的分析
• 4.2.2 遗传图谱构建
• 4.3 亚麻EST-SSR 的功能分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文