褐牙鲆干扰素调节因子3（IRF-3）和干扰素调节因子7（IRF-7）的全长cDNA克隆与表达分析

论文摘要

褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国重要的海水养殖鱼类之一,近年来,随着褐牙鲆人工养殖规模的快速发展,各种疾病随之发生,尤其是病毒性病害给我国牙鲆养殖业带来了巨大的经济损失,因此对牙鲆免疫机理的研究对于控制牙鲆病害具有重要的意义。褐牙鲆属于低等脊椎动物,干扰素系统是其实现免疫防卫功能的重要分子基础。干扰素调节因子（Interferon regulatory factors,IRFs）-3和-7属于干扰素调节因子家族成员,它们是一类多功能的转录因子,在调节干扰素和干扰素刺激基因的转录过程中发挥了重要的作用。目前,褐牙鲆IRF-3和-7尚未被克隆。本文采用逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA ends, RACE）方法从褐牙鲆头肾组织中克隆出IRF-3和IRF-7的全长cDNA分子。IRF-3 cDNA有两种长度不同的变异体（GenBank登录号：GU017417,GU017418）,它们是由Poly（A）加尾位点不同所致。褐牙鲆IRF-3 cDNA分子包含1404 bp开放性阅读框,编码464个氨基酸,5’非翻译区（5’UTR）长245 bp,长变异体3’非翻译区（3’UTR）长553 bp,短变异体3’UTR长327 bp。推断的IRF-3氨基酸序列中拥有DNA结合域（DBD）、IRF相关域（IAD）、丝氨酸富含域（SRD）等功能域。褐牙鲆IRF-7 cDNA（GenBank登录号：GU017419）由2032 bp组成,包括1293 bp编码区,编码430个氨基酸,5’UTR长84 bp,3’UTR长655 bp,推断的氨基酸序列也具有典型的DBD、IAD和SRD结构域。序列分析表明褐牙鲆IRF-3与IRF-7分别与其它脊椎动物的IRF-3与IRF-7有较高的同源性,进化分析将褐牙鲆IRF-3和IRF-7分别聚类于脊椎动物IRF-3和IRF-7分子簇,并同属于IRF-3亚家族。采用RT-PCR方法进行了IRF-3和IRF-7的组织分布研究。结果表明,IRF-3基因在体肾、脾和皮肤中表达水平较高,中等程度表达于食道、胃、肠、膀胱、·肌肉、头肾,而在脑、咽和性腺中表达最弱。牙鲆IRF-7基因在各个组织中都有较明显的表达,其中在脑、鳃、咽、食道、胃、肠和膀胱中呈现高水平的表达,在心脏、头肾、体肾、脾、性腺和皮肤中中等程度的表达。为了解褐牙鲆IRF-3和IRF-7基因的表达规律及其在干扰素信号系统中的地位与作用,本文利用real time PCR技术检测多聚肌胞（PolyI:C）刺激和淋巴囊肿病毒（LCDV）感染对褐牙鲆IFN-I （GenBank登录号：AB511962）、IFN-γ（GenBank登录号：AB435093）、IRF-3、IRF-7、Mx（GenBank登录号：AB110446）基因在牙鲆细胞（FG9307）和头肾中的表达影响及并分析了它们的联动表达规律。研究发现,经PolyI:C刺激或LCDV感染牙鲆细胞后,IRF-3、IRF-7、IFN-γ和Mx基因均上调表达,而IFN-I基因的表达却没有检测到。在PolyI:C刺激细胞组中,IRF-3和IRF-7的表达峰值出现在24h,均约为对照水平的3倍；IFN-y的表达峰值出现在48h,为对照水平的4倍；Mx的表达峰值出现在48h,约为对照水平的7倍。在LCDV感染细胞组中,IRF-3和IRF-7的表达峰值出现在72h,分别是对照水平的7和6倍；IFN-γ在48h后开始检测到上调表达,于96h达到峰值,为对照水平的5倍；Mx的表达峰值出现在96h,约为对照水平的7倍。LCDV感染褐牙鲆后,IFN-I、IFN-γ、IRF-7和Mx基因在头肾组织中均上调表达。IFN-I的表达量于感染后3天达到最高峰,为对照水平的48倍；IRF-7、IFN-γ和Mx基因的表达量均于感染后5天达到最高峰,分别为对照水平的14、25和80倍；IRF-3则组成型地表达于褐牙鲆的头肾组织中,其表达水平不受LCDV感染的影响。以上研究结果表明干扰素系统存在于褐牙鲆中,IRF-3和IRF-7,特别是IRF-7在褐牙鲆的抗病毒反应过程中发挥了重要的作用。本项研究为深入了解褐牙鲆的干扰素信号系统、开展相关的转基因抗病育种及开发抗病毒药物等工作奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 鱼类干扰素系统的研究进展
• 1.1 鱼类干扰素的发现及其作用
• 1.2 鱼类干扰素分子的分类及结构
• 1.3 鱼类干扰素的作用机理
• 1.4 鱼类干扰素诱导蛋白
• 2 鱼类干扰素调节因子家族的研究进展
• 2.1 鱼类干扰素调节因子的分类及分子结构
• 2.2 鱼类干扰素调节因子的作用
• 2.3 鱼类IRF-3和IRF-7的研究进展
• 3 本项研究的目的与意义
• 第二章 褐牙鲆IRF-3和IRF-7全长cDNA克隆和序列分析
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物、菌种及质粒
• 1.2 主要设备与仪器
• 1.3 主要试剂及溶液配制
• 2 实验方法
• 2.1 褐牙鲆组织的获取
• 2.2 总RNA的提取及质量检测
• 2.3 cDNA第一链的合成
• 2.4 核心片段的克隆及测序
• 2.5 3'RACE和5'RACE片段的克隆及测序
• 2.6 全长序列的克隆及测序
• 2.7 序列分析与进化树的构建
• 3 结果分析
• 3.1 RNA样品的制备与质量检测
• 3.2 核心片段的克隆及测序结果
• 3.3 3'RACE片段的克隆及测序结果
• 3.4 5'RACE片段的克隆及测序结果
• 3.5 全长序列的克隆及测序结果
• 3.6 IRF-3和IRF-7基因cDNA的序列分析
• 4 讨论
• 第三章 褐牙鲆IRF-3和IRF-7基因的表达分析
• 1 褐牙鲆IRF-3和IRF-7 mRNA的组织分布研究
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 褐牙鲆各组织的获取
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 总RNA的提取
• 1.2.4 cDNA的合成
• 1.2.5 RT-PCR分析
• 1.3 结果分析
• 2 PolyI:C刺激和病毒感染对IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达影响研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物、细胞系及病毒株
• 2.1.2 主要仪器与设备
• 2.1.3 主要试剂及溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PolyI:C刺激和LCDV感染牙鲆细胞
• 2.2.2 LCDV感染牙鲆鱼体
• 2.2.3 总RNA的提取
• 2.2.4 cDNA的合成
• 2.2.5 Real-time PCR
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 PolyI:C刺激牙鲆细胞后IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达
• 2.3.2 LCDV感染牙鲆细胞后IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达
• 2.3.3 LCDV感染褐牙鲆后IRF-3,IRF-7,IFN-I,IFN-γ,Mx基因的表达
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表的学术论文