产β-葡聚糖酶菌株的诱变育种、发酵产酶及其性质研究

论文摘要

β-葡聚糖酶是重要的工业用酶,它可以有效地降解大麦等谷物中的β-葡聚糖,因此,在饲料和啤酒生产中都发挥着重要作用。本论文主要研究了β-葡聚糖酶高产菌的诱变选育及其最适摇瓶发酵产酶条件、最佳产酶培养基、酶学性质及稳定性几个方面,主要结论如下:对出发菌株宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）M12进行紫外诱变及紫外线与光复活交替诱变,经过初筛和复筛,得到了β-葡聚糖酶的高产菌株M12-9-5,其产酶酶活达到了57.85U/mL,比出发菌株提高了88%,该菌株遗传稳定性良好。通过单因素实验,确定了该菌株产酶的最佳摇瓶发酵产酶条件:发酵温度为30℃,初始pH值为5.5,装液量为30mL/250mL,摇床转速200r/min,种龄为18h,接种量13%,发酵时间为72h。利用Placket-Burman实验和响应面实验,对其摇瓶发酵产β-葡聚糖酶的培养基进行了优化,最佳培养基组成（g/L）为:大麦粉25.10、麸皮14.90、（NH4）2SO4 20.00、NaH2PO4 1.15、CaCO3 5.00、蛋白胨30.00、吐温80 1.50、麦芽糖5.00、FeSO4·7H2O 0.20、CaCl2 1.56和NaCl 1.44,最高酶活达到307.20U/mL。根据摇瓶发酵结果,进行了5L发酵罐放大实验,结果表明:在60h酶活达到最高,最高酶活达到323.91 U/mL,发酵周期比摇瓶发酵缩短了12h。对该酶的性质研究表明:该酶最适反应温度为55℃,最适反应pH为4.5;在50℃以下和pH 3.07.0范围内比较稳定;在1mmol/L的浓度下,Co2+、Ca2+、Fe2+、Na+对其有一定的激活作用;Sn2+、Pb2+、Zn2+则有强烈的抑制作用。胃蛋白酶和胰蛋白酶对该酶活性影响不大。黄原胶、甘油、白蛋白、NaCl和CaCl2·2H2O等保护剂,能够在一定程度上提高酶的热稳定性。经正交实验和验证实验,最终选择了组成为黄原胶4g/L、CaCl2·2H2O 2.0mmol/L和甘油50g/L的复合保护剂。复合保护剂提高了酶的热稳定性,使酶的主要活力损失范围由50℃70℃提高到了55℃70℃;复合保护剂和1g/L山梨酸钾配合使用能明显提高酶液的储藏稳定性,在室温下放置三个月,相对残留酶活高达88.47%,比未添加保护剂的提高15%左右。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 β-葡聚糖及其水解酶系
• 1.2.1 β-葡聚糖的分布
• 1.2.2 β-葡聚糖的结构及负作用
• 1.2.3 β-葡聚糖的水解酶系
• 1.3 β-葡聚糖酶的生产研究概况
• 1.3.1 β-葡聚糖酶的来源
• 1.3.2 β-葡聚糖酶高产菌株的诱变选育
• 1.3.3 国内外β-葡聚糖酶的生产研究现状
• 1.3.4 β-葡聚糖酶酶活的测定
• 1.3.5 β-葡聚糖酶的性质
• 1.3.6 提高酶稳定性的研究
• 1.4 β-葡聚糖酶在啤酒和饲料工业的应用
• 1.4.1 β-葡聚糖酶在啤酒酿酒中的应用
• 1.4.2 在饲料中的应用
• 1.5 选题背景及研究内容
• 第二章 β-葡聚糖酶生产菌的诱变育种及其摇瓶发酵条件优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 出发菌株
• 2.2.2 主要药品和试剂
• 2.2.3 仪器和设备
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 培养方法
• 2.2.6 大麦β-葡聚糖的提取
• 2.2.7 酶活的测定
• 2.2.8 诱变处理
• 2.2.9 突变株的的分离筛选
• 2.2.10 突变株的遗传稳定性研究
• 2.2.11 突变株摇瓶发酵条件的确定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 紫外线照射剂量的确定
• 2.3.2 紫外诱变结果
• 2.3.3 紫外线照射与光复活交替处理结果
• 2.3.4 高产菌的遗传稳定性
• 2.3.5 菌株诱变谱系
• 2.3.6 M12-9-5 最佳摇瓶发酵条件的确定
• 2.4 本章小结
• 第三章 发酵培养基的优化和发酵罐放大实验
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要药品和试剂
• 3.2.2 仪器和设备
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 培养方法
• 3.2.5 酶活的测定
• 3.2.6 实验设计
• 3.2.7 5L 发酵罐放大实验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 单因素实验
• 3.3.2 Placket-Burman 实验
• 3.3.3 响应面实验
• 3.3.4 5L 发酵罐放大实验
• 3.4 本章小结
• 第四章 β-葡聚糖酶的性质和稳定性研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要药品和试剂
• 4.2.2 仪器和设备
• 4.2.3 酶活的测定
• 4.2.4 粗酶液的制备
• 4.2.5 酶的基本性质
• 4.2.6 保护剂对酶稳定性的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 粗酶液的制备
• 4.3.2 粗酶液的最适反应pH 值
• 4.3.3 粗酶液的pH 稳定性
• 4.3.4 粗酶液的最适反应温度
• 4.3.5 粗酶液的热稳定性
• 4.3.6 金属离子对酶活的影响
• 4.3.7 胃蛋白酶和胰蛋白酶对酶活的影响
• 4.3.8 添加保护剂对酶稳定性的影响
• 4.4 本章小结
• 主要结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文