甜菜离体培养直接器官发生及遗传转化的研究

论文摘要

甜菜是重要的糖用和饲料作物,糖用甜菜提供了全球约30%的食糖;饲料甜菜是家畜最佳的多汁饲料,块根肥大,营养丰富。由于栽培驯化时间较短,加上它又是一种2年生的异交作物,遗传背景狭窄,资源贫乏。特别是自交高度不亲和性,往往使得优良单株基因型很容易丢失,给优良品种选育材料的繁殖和保存带来了极大困难。现代生物技术的发展给甜菜育种方法开辟了一条新途径。然而,由于甜菜组织培养重复性差,愈伤组织难以诱导,植株再生受基因型限制,这些问题严重影响到植物基因工程技术在甜菜育种上的实际应用,加剧了传统育种方法的局限性,导致我国糖甜菜与甘蔗糖竞争中处于极大劣势;同时伴随着多种病害的影响,导致种植面积大幅度减少,产业的发展面临严峻考验。针对上述存在的诸多问题,本研究以甜菜六个不同品种为材料,在高频率诱导多芽的基础上,进行抗病基因的转化及检测,并分析材料在不同阶段的同工酶变化,为培育新种质奠定基础。1用供试的六个材料,切取子叶节,接入诱导多芽培养基上进行培养:不同品种间的多芽诱导率差异不大,在以子叶节为外植体,对芽进行诱导时,不受基因型限制。2所用卡那霉素的浓度为150mg/L,抗性不定芽分化率较高。羧苄青霉素的浓度为800mg/L时,才能有效抑制感染外植体的农杆菌。如有返菌现象,可用含800mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗,即可抑菌,且对材料无伤害。乙酰丁香酮（AS）可诱导基因的活化,可提高转化率,本试验加入量为100mg/L。3采用BA和NAA的激素组合,进行茎节外植体芽的诱导,随着BA浓度的提高,芽诱导率也提高,但有部分玻璃化苗的出现,切去叶片,留茎节,可长出正常芽。在供试品种中,51130,51132较其它品种玻璃化程度高。4用小芽进行扩繁时,材料不受基因型限制;在用叶片和叶柄进行多芽诱导时,受材料基因型的限制,不同品种诱导率有差异。5在生根时,加入IBA3-5mg/L,加300mg/L的羧苄青霉素,不加卡那霉素,10d左右可看到有根尖冒出,20天后根系发达。6在对转RF和PBVP6基因的植株进行PCR检测时,可以清楚地看到在相应于阳性对照位置上有些转化的甜菜植株显示了条带,即含有BNYVV CP和BBSV基因的PCR扩增片断,可初步表明所转基因存在于有阳性条带的转化甜菜中。7甜菜在加入6-苄氨基嘌呤（6-BA）诱导直接多芽发生的过程中,POD、EST同工酶和可溶性蛋白出现了酶带条数和颜色深浅的变化,推知其变化可能与控制多芽发生的代谢活动有关;遗传转化后出现了明显的酶带颜色加深和新酶带的增加,这是否由于外源基因的导入甜菜而具有抗逆性的标志,还是转基因的直接作用效果还有待于做进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物组织培养理论基础、应用及发展概况
• 1.1.1 植物组织培养的概述
• 1.1.2 植物组织培养的理论
• 1.1.3 植物组织培养再生植株途径及方式
• 1.1.4 植物组织培养技术应用及发展趋势
• 1.2 转基因植物研制、应用及发展
• 1.2.1 植物基因工程概述
• 1.2.2 用于转化的基因
• 1.2.3 转化方法
• 1.2.4 转基因植物的检测与鉴定
• 1.2.5 转基因植物的安全性评价
• 1.2.6 转基因植物应用和发展趋势
• 1.3 植物病毒病的研究及其成果
• 1.3.1 植物病毒病的研究历史
• 1.3.2 抗性机理
• 1.3.3 国内外研究成果
• 1.4 甜菜组织培养研究进展
• 1.4.1 花药培养
• 1.4.2 未授粉胚珠培养
• 1.4.3 胚培养
• 1.4.4 悬浮细胞培养
• 1.4.5 原生质体培养
• 1.4.6 离体筛选和诱变育种
• 1.4.7 器官发生诱导植株再生
• 1.5 甜菜遗传转化
• 1.5.1 农杆菌介导法
• 1.5.2 直接转化法
• 1.5.3 花粉管通道法
• 1.6 甜菜BBSV 和BNYVV 的研究
• 1.6.1 BBSV
• 1.6.2 BNYVV
• 1.7 同工酶在甜菜上的应用
• 1.8 本研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试植物材料
• 2.1.2 菌种与基因
• 2.1.3 试剂材料
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养条件
• 2.2.2 培养基配制与配方
• 2.2.3 种子消毒培养无菌苗
• 2.2.4 外植体制备
• 2.2.5 遗传转化体系的建立
• 2.2.6 转化因素的优化筛选
• 2.2.7 抗性植株的扩繁
• 2.2.8 甜菜总DNA 提取及检测
• 2.2.9 过氧化物酶和酯酶同工酶酶谱
• 2.2.10 可溶蛋白SDS-PAGE 电泳
• 第三章 结果与分析
• 3.1 子叶节外植体的多芽诱导
• 3.1.1 子叶节外植体不同品种的多芽诱导
• 3.1.2 子叶节外植体不同激素组合的多芽诱导
• 3.2 培养条件对甜菜转化的影响
• 3.2.1 浸染方法
• 3.2.2 共培时间对外植体的影响
• 3.2.3 羧苄青霉素（Cb）的浓度
• 3.2.4 卡那霉素的浓度
• 3.3 转化茎节外植体的多芽诱导
• 3.3.1 茎节外植体不同激素的多芽诱导
• 3.3.2 茎节外植体不同品种的多芽诱导
• 3.4 转化植株的扩繁
• 3.4.1 较小抗性芽的扩繁
• 3.4.2 转化植株的叶片直接出芽
• 3.4.3 转化植株的叶柄直接出芽
• 3.5 生根和移栽
• 3.6 转化植株的检测
• 3.6.1 不同方法的DNA 提取
• 3.6.2 转pBVP6 再生甜菜植株的PCR
• 3.6.3 转RF 再生甜菜植株的PCR
• 3.6.4 转化植株和非转化植株的比较
• 3.7 POD 同工酶酶谱的变化
• 3.8 EST 同工酶的变化
• 3.9 可溶蛋白的变化
• 3.10 讨论
• 3.10.1 子叶节外植体的多芽诱导
• 3.10.2 甜菜转化的影响因素
• 3.10.3 转化茎节外植体芽的诱导
• 3.10.4 转化植株的扩繁
• 3.10.5 生根和移栽
• 3.10.6 PCR
• 3.10.7 同工酶
• 第四章 结论
• 本研究论文创新点
• 参考文献
• 附录――缩略词表
• 致谢
• 个人简介