论文摘要
壳聚糖是一种天然的阳离子多糖,具有良好的生物相容性,生物降解性,低免疫原性以及无毒性的优点。壳聚糖通过静电作用可以与DNA形成聚电解质复合物,保护DNA免受核酸酶的降解,从而促使DNA顺利的进入细胞,因此壳聚糖作为非病毒基因载体具有广泛的应用前景。本文制备了两种新型的壳聚糖非病毒载体,精氨酸修饰的壳聚糖（Arg-CS）和N-亚甲基磷酸化壳聚糖（NMPCS）,探讨其物理化学性质及其与DNA之间的相互作用及基因转染行为,对壳聚糖载基因纳米粒子荧光标记条件进行了优化,探讨了精氨酸修饰壳聚糖载基因血管支架体内局部释放基因的可行性,具体内容主要包括以下几个方面:1、精氨酸修饰的壳聚糖的制备及其与DNA相互作用的研究。通过红外光谱和核磁共振图谱分析,可以确认精氨酸已经共价连接到壳聚糖上。圆二色谱结果表明DNA与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍然保持着典型的B型构象。用透射电镜,原子力显微镜和光子相关光谱检测复合物的表面形态和尺寸大小分布,结果表明,精氨酸修饰的壳聚糖/DNA纳米复合物（N/P=2:1）呈现不规则的球形,复合物的直径分布大多在80～150nm之间,有利于基因转染。2、精氨酸修饰的壳聚糖介导的基因转染研究。精氨酸修饰的壳聚糖介导荧光素酶质粒的表达较未修饰的壳聚糖介导的荧光素酶质粒的表达提高了大约100倍,在整个实验浓度范围内,精氨酸修饰的壳聚糖及其与DNA的复合物对HeLa细胞的毒性非常小。3、N-亚甲基磷酸化壳聚糖的制备及其与DNA相互作用的研究。以红外光谱（FTIR）分析表明改性后的壳聚糖的特征基团有显著变化;13C NMR检测进一步证明了亚甲基磷酸基团的引入。通过复凝聚的方法,制备了纳米尺寸的NMPCS/DNA聚电解质复合物。考察了共聚物与DNA的相互作用情况,复合物中DNA的构象变化和复合物的形态和粒径。圆二色谱结果表明DNA与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍然保持着典型的B型构象。透射电镜,原子力显微镜检测结果表明,不同N/P下的N-亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖/DNA纳米复合物呈现较规则的球形,且在高电荷比时可形成尺寸较小的纳米尺度颗粒。4、以人宫颈癌细胞HeLa为宿主细胞,尝试了以NMPCS为载体介导含荧光素酶的pGL3质粒的体外转染,重点研究了pH值和N/P比对转染效率的影响。实验结果表明,载体可有效将质粒转染HeLa细胞,获得的最佳转染效率远高于裸DNA和CS,与PEI相当。基于磷酸基团对钙离子有良好的鳌合能力制备了聚合物盐型NMPCS-Ca载体,并用于介导基因转染,其转染过程类似于传统的P-Ca载体,并认为Ca2+离子通道促进了转染过程。5、壳聚糖载基因纳米粒子荧光标记的优化研究。考察了FITC与壳聚糖反应的主要影响因素,观察了荧光标记对纳米粒子表征和转染效率的影响,建立一种快速、稳定并且适宜壳聚糖纳米载体示踪的荧光标记方法。壳聚糖纳米粒子表征和转染效率实验显示最佳的壳聚糖标记条件是反应物壳聚糖与FITC的添加比例为25:1,在pH值7.5室温25℃反应4小时。6、精氨酸修饰壳聚糖载基因支架血管内基因转运的研究。细胞转染实验显示,支架表面细胞及支架邻近细胞大量转染,远离支架细胞未见转染。动物实验结果显示,支架植入部位荧光素酶高表达,同时有2只动物肝脏标本有微量表达,其他部位未见表达。精氨酸修饰壳聚糖质粒DNA支架有望成为一种新型有效的血管内基因转运体系。
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中文摘要Abstract第一章 绪论1.1 引言1.1.1 基因治疗的概念1.1.2 基因治疗的历史回顾及我国的研究现状1.1.3 基因治疗的途径1.1.4 基因治疗的策略1.1.5 基因治疗的步骤1.1.6 基因转运递送过程1.1.6.1 转运递送过程的障碍1.1.6.2 基因转染过程中复合物跨越各道障碍的可能方法和途径1.1.7 基因治疗的应用1.1.8 基因治疗中有待解决的关键问题1.1.9 理想载体的特征1.2 非病毒载体1.2.1 裸DNA1.2.2 脂质体1.2.3 聚合物1.2.3.1 聚L-赖氨酸1.2.3.2 聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）1.2.3.3 树状聚合物1.2.3.4 明胶1.2.4 其它聚合物1.2.5 复合载体1.2.5.1 脂质复合物1.2.5.2 拟病毒颗粒1.2.6 基于抗体的靶向基因传递系统1.3 壳聚糖非病毒载体1.4 论文工作的提出第二章 精氨酸修饰壳聚糖的制备及其与DNA相互作用的研究2.1 引言2.2 实验部分2.2.1 原料与仪器2.2.1.1 原料2.2.1.2 仪器2.2.2 精氨酸修饰的壳聚糖缀合物的制备2.2.3 精氨酸修饰的壳聚糖/DNA纳米复合物的制备2.2.4 材料的表征2.2.4.1 红外光谱分析（FTIR）13C核磁共振分析（NMR）'>2.2.4.213C核磁共振分析（NMR）2.2.4.3 凝胶电泳阻滞实验（Gel Retardation Assay）2.2.4.4 光子相关光谱分析（PCS）2.2.4.5 透射电镜观察（TEM）2.2.4.6 原子力显微镜观察（AFM）2.2.4.7 圆二色谱分析（CD）2.3 结果与讨论2.3.1 红外光谱分析13C核磁共振分析'>2.3.213C核磁共振分析2.3.3 凝胶电泳阻滞实验分析2.3.4 光子相关光谱分析2.3.5 透射电镜观察2.3.6 原子力显微镜观察2.3.7 圆二色谱分析2.4 结论第三章 精氨酸修饰的壳聚糖介导基因转染的实验研究3.1 引言3.2 实验部分3.2.1 原料与仪器3.2.1.1 原料3.2.1.2 仪器3.2.2 质粒的图谱3.2.3 质粒DNA的提取3.2.3.1 质粒DNA的小量提取3.2.3.2 质粒DNA的大量提取3.2.4 平滑肌细胞的培养3.2.4.1 培养液的准备3.2.4.2 血管平滑肌原代细胞的组织块培养3.2.4.3 血管平滑肌细胞的培养3.2.5 Lipofectamine试剂介导pIRES2-EGFP质粒体外转染平滑肌细胞3.2.6 精氨酸修饰的壳聚糖介导pIRES2-EGFP质粒体外转染平滑肌细胞3.2.7 精氨酸修饰的壳聚糖及其复合物对HeLa细胞的细胞毒性评价3.2.8 精氨酸修饰的壳聚糖转染荧光素酶质粒的实验研究3.3 结果与讨论3.3.1 Lipofectamine试剂介导pIRES2-EGFP质粒体外转染平滑肌细胞3.3.2 精氨酸修饰的壳聚糖介导pIRES2-EGFP质粒体外转染平滑肌细胞3.3.3 精氨酸修饰的壳聚糖细胞毒性实验3.3.4 精氨酸修饰的壳聚糖荧光素酶转染实验3.4 结论第四章 N-亚甲基磷酸化壳聚糖的制备及其与DNA相互作用的研究4.1 引言4.2 实验部分4.2.1 原料与仪器4.2.1.1 原料4.2.1.2 仪器4.2.2 磷酸化壳聚糖（NPCS）的制备4.2.3 红外光谱（FTIR）分析13C核磁共振分析（NMR）'>4.2.413C核磁共振分析（NMR）4.2.5 N-亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖NMPCS/DNA纳米复合物的制备4.2.6 凝胶电泳阻滞实验（Gel Retardation Assay）4.2.7 激光粒度分析仪4.2.8 透射电镜观察（TEM）4.2.9 原子力显微镜观察（AFM）4.2.10 圆二色谱分析（CD）4.3 结果与讨论4.3.1 红外光谱（FTIR）分析4.3.2 核磁共振分析（NMR）4.3.3 凝胶电泳阻滞实验4.3.4 透射电镜观察结果分析4.3.5 激光粒度分析仪测试复合物粒径4.3.6 原子力显微镜观察（AFM）4.3.7 圆二色谱分析（CD）4.4 结论第五章 N-亚甲基磷酸化壳聚糖介导基因转染的研究5.1 引言5.2 实验部分5.2.1 原料与仪器5.2.1.1 原料5.2.1.2 仪器5.2.2 菌体的培养及质粒的提取纯化5.2.3 转染细胞的准备5.2.4 亚甲基磷酸化壳聚糖及其复合物对HeLa细胞的细胞毒性评价5.2.5 亚甲基磷酸化壳聚糖转染荧光素酶质粒的实验研究5.2.6 亚甲基磷酸化壳聚糖盐型NMPCS-Ca/DNA复合物制备及转染研究5.3 结果与讨论5.3.1 细胞毒性分析5.3.2 NMPCS/DNA复合物基因转染实验结果5.3.3 聚合物－无机盐型NMPCS-Ca/DNA复合物转染结果5.4 结论第六章 壳聚糖基非病毒载体荧光标记的研究6.1 引言6.2 实验部分6.2.1 原料与仪器6.2.1.1 原料6.2.1.2 仪器6.2.2 壳聚糖的FITC标记6.2.3 质粒DNA的荧光修饰6.2.4 标记效率的测定6.2.5 质粒DNA的提取和壳聚糖载基因纳米粒子的制备6.2.6 壳聚糖载基因纳米粒子的表征检测6.2.7 CNP体外细胞转染实验6.2.8 纳米粒子细胞内分布的初步研究6.2.9 统计学处理6.3 结果与讨论6.3.1 壳聚糖的荧光修饰6.3.2 反应温度对标记效率的影响6.3.3 凝胶电泳阻滞实验6.3.4 壳聚糖载基因纳米粒子体外细胞转染实验6.3.5 激光共聚焦显微镜观察6.4 结论第七章 精氨酸修饰壳聚糖载基因血管支架的研究7.1 引言7.2 实验部分7.2.1 原料与仪器7.2.1.1 原料7.2.1.2 仪器7.2.2 精氨酸修饰壳聚糖质粒DNA纳米粒子（ACDNPs）的制备及表征7.2.3 精氨酸修饰壳聚糖基因支架的制备7.2.4 技术路线7.2.5 精氨酸修饰壳聚糖基因支架细胞基因转染实验7.2.6 精氨酸修饰壳聚糖基因支架兔颈动脉植入实验7.3 结果与讨论7.3.1 ACDNPs支架扫描电镜观察7.3.2 精氨酸修饰壳聚糖基因支架细胞基因转染实验7.3.3 精氨酸修饰壳聚糖基因支架兔颈动脉植入实验7.4 结论全文主要结论参考文献攻读博士学位期间完成的论文致谢
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