核酸佐剂GM-CSF的克隆及其对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用

论文摘要

本研究应用基因克隆、细胞培养、酶免疫测定、放射免疫测定、半定量RT-PCR和化学分析等技术，首先克隆了猪和山羊的GM-CSF基因，与其它物种比较，分析它们在核苷酸和氨基酸水平上的同源性，以pcDNA3.1（-）为质粒载体构建了猪的GM-CSF真核表达质粒pGM-CSF，转染真核细胞，检测GM-CSF特异性蛋白的表达。在生长抑素表达质粒pcS／2SS的基础上构建GM-CSF与生长抑素（SS）融合表达质粒pGM-CSF／SS，并转入减毒沙门氏菌构建DNA疫苗重组菌，检测该真核表达质粒在体内外的稳定性和对小白鼠的安全性。然后，将pcS／2SS、pGM-CSF／SS和pGM-CSF+pcS／2SS分别以肌肉注射和口服两种途径免疫小鼠，检测小鼠产生的免疫应答、GH和IGF-Ⅰ水平、肝脏和肌肉组织中GHR和IGF-Ⅰ mRNA的表达。最后将pcS／2SS、pGM-CSF／SS和pGM-CSF+pcS／2SS口服免疫断奶仔猪，分析免疫中和促生长的效果、激素水平和某些代谢物浓度的变化，以探讨GM-CSF对生长抑素DNA疫苗免疫增强作用的基本机理，为进一步调节动物生长轴功能，促进SS DNA疫苗在动物生产中的应用提供理论依据。 1 GM-CSF基因克隆、序列分析及表达 克隆猪和山羊的GM-CSF基因，序列分析表明，这两个物种的cDNA开放阅读框均为435bp，编码144个氨基酸。猪GM-CSF序列同绵羊、人、牛、小鼠和犬比较，其核苷酸的同源性分别为86.2％、80.5％、81.7％、69.7％和81.8％，氨基酸的同源性分别为78.5％、71.3％、70.3％、55.9％和71.5％；山羊GM-CSF序列与绵羊、猪、人、牛、小鼠和犬比较，其核苷酸的同源性分别为98.8％、88.7％、89.3％、91.3％、74.0％和89.9％，氨基酸的同源性分别为97.2％、79.2％、81.8％、82.1％、58.6％和73.6％。将猪GM-CSF基因插入真核表达载体pcDNA3.1（-）构建真核表达质粒pGM-CSF，并转染COS-7细胞，Western blotting结果显示，重组质粒可在哺乳动物细胞中表达特异性的GM-CSF蛋白。 2 GM-CSF与SS生长抑素融合表达质粒的构建与鉴定 将GM-CSF基因亚克隆到生长抑素真核表达质粒pcS／2SS，构建GM-CSF与生长抑素（SS）的融合表达质粒pGM-CSF／SS，酶切和测序表明，GM-CSF与生长抑素（SS）的融合表达质粒pGM-CSF／SS构建成功，为研究GM-CSF基因对生长抑素DNA疫苗

论文目录

• 原创性声明
• 学位论文版权使用授权书
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩写语说明
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 生长抑素基因免疫的意义与研究进展
• 1 生长抑素基因免疫意义
• 2 生长抑素基因免疫研究进展
• 参考文献
• 第二章 基因佐剂研究进展
• 1 基因佐剂种类
• 2 基因佐剂增强DNA疫苗免疫应答的作用机制
• 3 基因佐剂表达载体的构建
• 参考文献
• 第三章 以减毒沙门氏菌为载体的基因免疫研究进展
• 1 细菌载体研究进展
• 2 减毒沙门氏菌用作载体的意义与研究进展
• 3 减毒沙门氏菌载体在基因免疫中可能存在的问题
• 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第四章 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因克隆、序列分析及其表达
• 1 材料和方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与生长抑素融合表达质粒的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六章 以减毒沙门氏菌为载体的GM-CSF与生长抑素DNA疫苗的安全性和稳定性
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第七章 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第八章 GM-CSF与生长抑素融合表达质粒对小鼠肝脏和肌肉组织GHR、IGF-I MRNA表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第九章 以减毒沙门氏菌为载体的GM-CSF与生长抑素融合表达质粒免疫断奶仔猪的效果
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 创新
• 攻读博士学位期间发表的学术论文目录
• 致谢
• 附录Ⅰ 试剂配制
• 附录Ⅱ 测序报告