论文摘要
目的研究显示,雌激素在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用,雌激素受体（estrogen receptor,ER）是生长调节基因,ER的阳性表达是乳腺癌患者进行内分泌治疗的依据,雌激素与ER结合可引发不同的细胞生长反应。研究还显示,位于细胞质中的线粒体也是雌激素作用的重要靶标,参与了细胞的增殖调控,线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）作为唯一的核外遗传物质,近年来也逐渐成为关注热点。临床数据显示,ER阴性表达的乳腺癌患者,也有部分临床上内分泌治疗有效,线粒体可能在其中扮演了一定角色,但目前还没有确切的研究结果证实,对其机理的研究更是鲜有报道。本研究的目的就是通过体外实验,探讨线粒体、mtDNA、雌激素、ER之间的关系及其在乳腺癌细胞生物学行为中的作用机制,为临床实现乳腺癌的个性化内分泌治疗提供理论基础和实验依据。方法（1）以ER阳性表达的人乳腺癌MCF-7细胞系为研究对象,双标免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微镜观察雌激素作用后ER的表达情况。（2）以ER阴性表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系为研究对象,小剂量EB长期培养法诱导建立mtDNA缺失的rho 0MDA-MB-231细胞,营养缺陷及PCR扩增鉴定mtDNA的缺失。电镜下观察细胞超微结构的差异,MTT法测定细胞增殖能力、划痕实验检测细胞迁移能力、流式细胞技术检测线粒体膜电位、CD-DST（Collagen GelDroplet Embeded Culture-Drug Sensitivity Test）法检测药物敏感性、免疫组化技术检测P-gp和BCRP的表达。（3）以MDA-MB-231细胞和rho0MDA-MB-231细胞为研究对象,雌激素干预,CD-DST法检测细胞增殖能力的变化,流式细胞技术检测细胞周期,电镜下观察细胞超微结构。（4）以MCF-7及MDA-MB-231细胞为研究对象,雌激素干预,提取细胞总RNA,逆转录荧光标记,寡核苷酸表达谱基因芯片检测基因的差异表达,GenPix Pro芯片图像分析软件进行统计学分析。结果1.雌激素作用MCF-7细胞后,除去细胞核的ER阳性表达,胞浆阳性表达信号增强。2.非选择培养和PCR扩增表明EB诱导的rho0MDA-MB-231细胞mtDNA缺失,和其母本MDA-MB-231细胞相比,rho0MDA-MB-231细胞线粒体数量增多,体积增大;细胞增殖能力、细胞迁移能力和集落形成能力增强;线粒体膜电位下降;对化疗药物相对抵抗,耐药相关蛋白表达增强。3.雌激素促进MDA-MB-231细胞增殖,但无明显剂量依赖性趋势,抑制rho0MDA-MB-231细胞增殖,且表现为剂量依赖性趋势;雌激素作用后,rho0MDA-MB-231细胞呈现G2/M期阻滞,线粒体肿胀和髓鞘样变,而MDA-MB-231细胞则积聚于S期,同时伴随粗面内质网扩张,核糖体颗粒增多。4.雌激素干预后,MCF-7细胞mtDNA编码ND4、ND4L及COXⅡ基因上调表达,而MDA-MB-231细胞mtDNA基因无明显差异表达。结论1.成功诱导建立了mtDNA缺失的人乳腺癌细胞rho0MDA-MB-231。2.线粒体损伤可能参与MDA-MB-231细胞恶性表型和耐药表型的形成。3.雌激素除了通过核ER途径发挥作用,可能尚有线粒体/mtDNA参与的其他信号通路存在。