CDV、CPV、CAV三联DNA疫苗的制备及实验免疫研究

论文摘要

当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的传染病主要有犬瘟热、犬细小病毒性肠炎及犬2型腺病毒喉气管炎和肝炎,本研究期望通过多联基因疫苗的研究达到对以上三种传染病产生有效预防保护的目的,同时可解决现有弱毒疫苗存在的可能返祖及母源抗体干扰问题。本研究针对犬瘟热病毒（CDV）H基因、犬细小病毒（CPV）VP1基因和犬2型腺病毒（CAV-2）F基因的核苷酸序列,设计并合成了三对引物,分别提取相应的DNA、RNA。CPV、CAV直接进行PCR扩增, CDV提取总RNA后,进行RT-PCR。得到的三种目的基因分别与真核表达载体pIRES进行连接,转化、测序;获得的三种免疫质粒经纯化后分别按200、400、800ug三种浓度混合,以市售9周龄且CDV、CPV、CAV中和抗体效价≤2的昆明犬作为实验用犬,混合质粒和200、400、800ug三种浓度的单种质粒磷酸盐溶液分别对实验犬进行免疫实验,以接种空质粒的犬作为对照;每隔8周接种一次,每次接种前采血,测定血清的抗体效价,在第三次接种4周后,对全部实验犬进行用CDV、CPV、CAV-1强毒株进行攻毒,攻毒后观察犬的发病情况,并在攻毒后第7天及14天时采血,测定血清的抗体效价。所有接种不同量pIRCDV-H、pIRESVP1、pIRES-F单种基因疫苗及混合基因疫苗的犬,两次免疫后与对照相比均可提高4-40倍不等的抗体水平,且混合基因疫苗相互之间不发生免疫干扰。攻毒后27只混合基因疫苗免疫的犬除有1只发病,但症状较轻,其余都能抵抗三种强毒的攻击;而接种空质粒的9只对照犬全部发病严重,证明所构建的核酸疫苗在一定程度上可抵抗这三种强毒的攻击。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 犬瘟热研究进展
• 1.1.1 附着或血凝（H）蛋白及其基因
• 1.1.2 CD 的疫苗研制
• 1.2 犬细小病毒的研究进展
• 1.2.1 CPV 的起源及进化
• 1.2.2 CPV 流行情况
• 1.2.3 CPV 和 FPV 核酸序列、蛋白氨基酸序列的比较
• 1.2.4 CPV 疫苗的研究现状
• 1.3 犬腺病毒研究进展
• 1.3.1 CAV 免疫研究进展
• 1.3.2 纤突结构研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株和质粒
• 2.1.2 实验动物及细胞
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 仪器设备
• 2.1.6 实验耗材
• 2.1.7 试剂配制
• 2.2 技术路线
• 2.3 方法
• 2.3.1 病毒扩增
• 2.3.2 引物设计
• 2.3.3 CPV DNA 的制备
• 2.3.4 CAV-2 病毒 DNA 的制备
• 2.3.5 CDV 总 RNA 的抽提
• 2.3.6 PCR 扩增 CPV VP1 基因
• 2.3.7 PCR 扩增 CAV-2 F 基因
• 2.3.8 RT-PCR 扩增 CDV H 基因
• 2.3.9 PCR 产物的回收
• 2.3.10 连接
• 2.3.11 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.12 连接产物的转化
• 2.3.13 转化菌落的快速鉴定
• 2.3.14 重组质粒DNA 的小量制备
• 2.3.15 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.16 插入片段的序列测定
• 2.3.17 免疫质粒的构建和序列测定
• 2.3.18 免疫质粒的纯化
• 2.3.19 免疫
• 2.3.20 抗体分析
• 2.3.21 攻毒
• 3 结果
• 3.1 免疫质粒的构建
• 3.1.1 CDV H 基因免疫质粒的构建
• 3.1.2 CPV VP1 片段的 PCR 扩增、克隆及重组质粒的酶切鉴定
• 3.1.3 CAV 纤突基因的 PCR 扩增、克隆及重组质粒的酶切鉴定
• 3.2 片段的序列测定及比较
• 3.2.1 CDV H 基因的序列及分析
• 3.2.2 CPV VP1 基因的序列及分析
• 3.2.3 CAV F 基因的序列及分析
• 3.3 抗体效价的测定
• 3.3.1 CDV 中和抗体效价的测定
• 3.3.2 CPV 血凝抑制效价测定
• 3.3.3 CAV 中和抗体效价的测定
• 3.4 攻毒实验
• 4 讨论
• 4.1 免疫质粒的纯化
• 4.2 免疫佐剂的选择
• 4.3 接种方法及剂量的选择
• 4.4 载体选择
• 4.5 基因疫苗的优缺点
• 4.6 抗体效价
• 5 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 在读期间发表的文章
• 致谢