锌指蛋白ZNF191（243-368）的表达、纯化及其性质研究

论文摘要

目前研究表明，人类基因组约由30亿个碱基对构成，仅5％左右的基因组序列编码蛋白，而据估计约占全部基因组1％的序列编码锌指蛋白。锌指蛋白中最为典型的就是Cys2His2（C2H2）型的锌指蛋白，而庞大的C2H2型锌指蛋白家族究竟在生物体内起到什么样的作用?就目前对锌指蛋白的认识而言，C2H2锌指蛋白可以和DNA、RNA或是蛋白质相互作用，从而作为调控因子在许多生理过程中起着重要的作用。而目前获得的锌指蛋白的数目有限，再加上锌指蛋白的晶体结构不易获得，使我们所能得到的锌指蛋白的结构信息更加有限，所以许多有关C2H2型锌指蛋白结构和功能的基本问题还有待进一步的研究。ZNF191基因是从人肝的cDNA文库中获得的，并被精确定位于人染色体的18q12.1区域。目前已发现这一区域与多种肿瘤和遗传疾病相关，这也提示ZNF191基因可能是这些遗传疾病和肿瘤的候选相关基因。而ZNF191（243-368）是ZNF191的锌指区蛋白，含有四个连续的C2H2锌指结构域，可能具有和特定的DNA序列结合的特性。我们希望通过研究可以得到ZNF191（243-368）特异性结合的DNA序列，可以了解ZNF191（243-368）中每一个锌指的性质与结构，以及在整个锌指区蛋白中所起到的作用，从而为我们揭示ZNF191在生物体中的功能提供有用的信息。要想对某一蛋白的性质、结构和功能有较为全面和深入的了解，获得稳定、高效和简便的表达与纯化方法是最基本的保障，是值得研究与探索的课题。我们在研究ZNF191（243-368）的过程中也发现，该锌指蛋白在表达和纯化上存在一定的困难，尤其是缺失锌指的突变体蛋白不易得到。为了寻求能够稳定表达ZNF191（243-368）的体系和得到简便的分离纯化方法，我们分别尝试了pTSA-18/BL21（DE3）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、His-tag和酮类同醇异构酶（KSI）表达体系，并对得到的蛋白进行了性质研究。pTSA-18/BL21（DE3）表达体系中，我们构建了ZNF191（243-368）及其三个缺失锌指的突变体基因（dF1、dF4、dF1F4），在E．coli．BL21（DE3）菌株中进行了表达。但是我们只得到了ZNF191（243-368），并且它的产率很低，4升LB培养基才能得到约1mg的蛋白，这可能与表达体系自身的性质以及缺失锌指的突变体蛋白的稳定性有关。这使得我们必须尝试其它的表达体系，以获得充足的ZNF191（243-368）及其缺失锌指的突变体蛋白，来进行性质研究。谷胱甘肽S-转移酶（GST）表达体系中，由于GST的协同表达作用，使得融合蛋白具有较高的表达水平，并且融合蛋白的纯化也相对简便、快速。同时利用GST对Glutathione Sepharose 4B树脂的特异亲和性，将随机合成的寡聚核苷酸库与结合着GST-ZNF191（243-368）融合蛋白的树脂混合，经过反复的洗涤、扩增等步骤，我们得到了和ZNF191（243-368）结合紧密的DNA序列。通过这一实验，我们得到了69个DNA序列，其中38个（55％）含有“AGGG”内核；还有12个（17％）序列含有同源性较强的AGGA、AGGC、AGGT序列。根据38个含有AGGG内核的序列，我们推测出ZNF191（243-368）可能结合的DNA序列为“GGAGGGG”。用“GGAGGGG”序列搜索“真核启动子数据库”，发现在人体中许多基因的启动子中含有这一序列，这与ZNF191蛋白在人体内普遍表达的性质相符，说明ZNF191在人体中可能具有基因调节功能。我们还用荧光方法研究了ZNF191（243-368）、EB对该DNA序列的竞争结合，结果表明ZNF191（243-368）与该DNA序列间存在较强的相互作用。GST对于融合蛋白的结晶化有较强的促进作用，我们希望能够从GST融合蛋白得到锌指蛋白的晶体结构。His-tag表达体系是近几年发展起来的，这一体系表达出的外源蛋白带有连续的组氨酸标记（His·Tag），用Ni2+-NTA树脂就可以简便、快速的纯化蛋白。许多研究表明，较小的His-tag不会影响目标蛋白的结构与功能。所以我们在这一表达体系中构建了ZNF191（243-368）、它的定点突变以及缺失锌指的突变体基因，最终得到了在N-端引入了（His）6-tag的（His）6-ZNF191（243-368），在C-端引入了（His）8-tag的ZNF191（243-368）-（His）8，（His）6-F3/H4（锌指3中的两个Cys突变为His），（His）6-F3/SS（锌指3中的两个疏水性的氨基酸残基突变为亲水性的Ser）。但是由于该体系中锌指蛋白的表达水平并不高，以及缺失锌指的突变体蛋白的稳定性较差，我们仍然没有得到缺失锌指的突变体蛋白。得到的这些His-tag蛋白一旦脱去锌离子，他们的CD光谱就发生了明显的变化，尤其是（His）6-F3/SS，这说明锌离子以及疏水性氨基酸残基的突变对蛋白的结构产生了影响。而随着锌离子的加入，除了ZNF191（243-368）-（His）8外，蛋白又逐渐恢复了原有的结构，表明C-端的His-tag干扰了ZNF191（243-368）在体外的正确折叠。我们还发现（His）6-F3/H4和ZNF191（243-368）-（His）8具有水解酶的活性，表明4个His与锌离子的配位，构成了类似于水解酶的活性位点。这可能也是不存在天然的4个His与锌离子配位的锌指蛋白的原因之一。研究表明，对于依赖于Cys和His配位的锌指蛋白来说，是否采用引入His-tag的表达方法仍然需要慎重。虽然，我们采用上述两个融合蛋白体系，得到了ZNF191（243-368）的DNA结合序列，并对ZNF191（243-368）及它的几个突变体蛋白进行了表达、纯化与性质研究，但是单个锌指的表达纯化在这两个体系中均不成功，而每个锌指的性质与结构到底有什么差别，仍然是我们主要关心的问题之一。为了得到单一的锌指蛋白，我们又尝试了酮类固醇异构酶（ketosteroid isomerase，KSI）表达体系。KSI表达体系中，我们以pET-31b为载体，在KSI的C-端分别引入了锌指3（ZF3）和锌指4（ZF4）的基因。KSI的协同表达作用以及难溶性，使得KSI与锌指的融合蛋白的表达水平很高，并且主要是以包涵体的形式存在，有效地防止了结构简单的单一锌指被蛋白水解酶所降解。破菌后的沉淀用不同浓度的尿素缓冲溶液进行洗涤，就可得到大量的、纯度较高的包涵体融合蛋白（纯度在80％以上），而且该融合蛋白可直接用于CNBr裂分。根据KSI与单一锌指在分子量上的差异进行分离，就可得到纯度达到95％以上的单一锌指肽，每升培养基的产量可以达到20mg。性质研究表明，锌指3和锌指4在结构上存在差异，并且锌离子是锌指正确折叠的必需因素。但是对于单一锌指肽的具体结构仍然有待进一步的研究。由以上的研究我们了解到，蛋白的表达与纯化并没有固定的规律可循，要想得到适合的表达体系，需要进行大量的实验来摸索。而在尝试这些表达体系的过程中，我们利用GST融合蛋白中GST对树脂的亲和性，得到了ZNF191（243-368）识别的DNA序列。由His-tag融合蛋白了解到锌离子和构成疏水内核的氨基酸残基是形成锌指结构域的要素，并获得了具有水解活性的突变体蛋白。由KSI表达体系，成功得到了ZNF191（243-368）的锌指3和锌指4，并且确定锌指3和锌指4在结构上存在这差异。这些结果加深了我们对锌指蛋白ZNF191（243-368）的性质、结构和功能关系的认识。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 2H₂型锌指蛋白的结构与功能'>一、C₂H₂型锌指蛋白的结构与功能
• 2H₂型锌指蛋白的研究热点'>二、C₂H₂型锌指蛋白的研究热点
• 三、ZNF191（243-368）的研究进展
• 四、本课题的研究思路、目标及意义
• 参考文献
• 第二章 pTSA-18/BL21（DE3）体系中ZNF191（243-368）的表达、纯化以及蛋白性质的研究
• 一、引言
• 二、实验部分
• 三、结果与讨论
• 四、结论
• 参考文献
• 第三章 GST体系中ZNF191（243-368）的表达、纯化以及蛋白性质的研究
• 第一节 GST-ZNF191（243-368）及其缺失锌指突变体基因的构建与蛋白的表达
• 第二节 ZNF191（243-368）的DNA靶序列
• 第三节 GST-ZNF191（243-368）的基本性质研究
• 参考文献
• 第四章 His-tag对ZNF191（243-368）性质和结构的影响
• 第一节 His·tag-ZNF191（243-368）及其突变体基因的构建与蛋白的表达
• 第二节 His-tag对ZNF191（243-368）及其突变体蛋白的性质和结构的影响
• 参考文献
• 第五章 KSI体系中单一锌指肽的表达、纯化和锌指肽基本性质的研究
• 第一节 ZNF191（243-368）单一锌指肽的基因构建与表达
• 第二节 ZF3和ZF4的性质与结构研究
• 参考文献
• 附录
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附录四
• 附录五
• 攻读博士期间己发表和待发表的文章
• 致谢