论文摘要
背景骨骼肌由慢缩肌纤维和快缩肌纤维组成。根据肌球蛋白ATP酶染色或/和肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）异构体的表达,成年啮齿动物骨骼肌纤维可单纯地分为Ⅰ型（氧化型慢缩肌）和Ⅱa型（糖氧化型快缩肌）、Ⅱb型（糖酵解型快缩肌）、Ⅱx型（介于Ⅱa与Ⅱb之间）。骨骼肌既是执行运动及调节机体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官,也是一高度可塑性器官。对不同的代谢功能需求和代谢变化（如运动、营养的改变）,骨骼肌纤维大小和类型可产生相应的适应性改变。人类许多代谢疾病如糖尿病等可出现肌萎缩、肌纤维类型改变,探究影响骨骼肌纤维转换和纤维大小的细胞内信号通路及它们之间的对话可为肌萎缩/病理性肥大相关疾病、残疾康复、糖尿病等代谢疾病的治疗及预防开发新药靶位点。运动和膳食是影响骨骼肌表型的重要因素。我们前期的预实验结果显示耐力运动和高脂膳食影响骨骼肌纤维类型和纤维大小。已清楚钙调神经磷酸酶（Calcineurin,CaN）/活化T细胞核因子（NFATc1）是调节骨骼肌纤维转换的重要通路,而AKt/S6K1/GSK-3是调节骨骼肌大小的重要通路,但两者是否参与了耐力运动和高脂膳食时骨骼肌表型的改变以及两通路间是否存在联系目前并不清楚。本研究拟通过二个在体实验探讨骨骼肌表型转变时CaN信号和AKt信号通路分子的活性变化及其联系。第一章耐力运动和高脂膳食对大鼠骨骼肌表型的交互影响【目的】明确大鼠不同类型骨骼肌在短期耐力运动和高脂膳食后肌纤维表型的适应性变化,为下一步研究提供依据。【方法】40只雄性SD大鼠（重150～180g）单纯随机等分为四组:正常饲养不训练组（正常组）、高脂饲养不训练组（高脂组）、正常饲养训练组（运动组）、高脂饲养训练组（高脂运动组）。正常膳食热卡（14.5KJ/g）配方为:碳水化合物占66%,蛋白质占21%,脂肪占13%;高脂膳食热卡（21KJ/g）配方:碳水化合物占20%,蛋白质占21%,脂肪占59%（以猪油为主）。运动方式:在坡度为0的电动跑台（有尾电激）进行训练（训练完后立即投食,次日晨8:00移去食物）,速度由20米/分递增至28米/分,每次运动1小时,每周6次,共6周。实验结束前三天,进行腹腔糖耐量试验（IPGTT）,实验结束时取空腹血用比色法分析空腹血糖（FBS）、甘油三酯（FTG）、游离脂肪酸（FFA）、血浆总氨基酸（FAA）,用放免法测空腹血浆胰岛素（FINS）。取大网膜脂肪、肾周脂肪和睾周脂肪作为腹内脂肪含量称重。取双侧比目鱼肌（SOL）和趾长伸肌（EDL）,右侧肌称重后用MHC SDS—PAGE电泳法、肌纤维ATPase染色法测定纤维类型和纤维横断面积,用比色法测定琥珀酸脱氢酶（SDH）、β-羟酰辅酶A脱氢酶（HADH）活性。【结果】1.6周的高脂膳食显著增加大鼠腹内脂肪含量、降低腹腔糖耐量,耐力运动则明显降低高脂膳食诱导的腹内脂肪积聚（高脂膳食组为13.56±6.54g,高脂运动组为7.63±2.15g,P＜0.05）、改善高脂膳食损害的腹腔糖耐量（高脂膳食组为27.14±3.40,高脂运动组为21.80±1.67,P＜0.05）。2.耐力运动升高趾长伸肌的SDH活性和HADH活性:而高脂膳食降低比目鱼肌的SDH活性,增加趾长伸肌的HADH活性。3.高脂膳食升高空腹血浆胰岛素浓度;耐力运动后摄入正常膳食和高脂膳食空腹血浆胰岛素不下降（正常组和运动组分别为10.67±3.59、12.18±3.34uIU/mL;高脂膳食组和高脂运动组分别为15.12±5.91、17.98±7.88 uIU/mL）。4.6周的无坡度跑台运动促进生长期大鼠比目鱼肌向慢肌纤维转换,高脂膳食倾向降低耐力运动诱导的比目鱼肌向慢肌纤维转换,但不影响趾长伸肌纤维类型。5.耐力运动和高脂膳食增加生长期大鼠比目鱼肌质量,但不影响比目鱼肌纤维横断面积;耐力运动和高脂膳食对趾长伸肌质量有交互影响,且耐力运动增加趾长伸肌TypeⅠ纤维横断面积,高脂膳食降低趾长伸肌TypeⅠ、TypeⅡb纤维横断面积。6.空腹血浆胰岛素浓度与比目鱼肌质量相关（rs=0.37,P=0.040）,但与比目鱼肌的纤维类型、趾长伸肌质量和纤维类型相关无显著性意义。【结论】1.高脂膳食损害腹腔糖耐量,而耐力运动改善腹腔糖耐量。2.耐力运动同步提高骨骼肌脂肪酸β氧化能力和线粒体氧化能力,而高脂膳食仅升高脂肪酸β氧化能力。3.耐力运动可诱导生长期大鼠比目鱼肌纤维转换。4.耐力运动和高脂膳食可影响骨骼肌质量和肌纤维横断面积。第二章耐力运动和高脂膳食对大鼠骨骼肌Calcineurin和Akt信号通路影响【目的】探讨耐力运动和高脂膳食引发骨骼肌表型改变时是否与Akt信号通路和CaN-NFATc1信号通路有关。【方法】左侧比目鱼肌和趾长伸肌用Western Blotting法测定磷酸化Akt、磷酸化S6K1、GSK-3和CaN、胞核NFATc1信号蛋白分子含量,同时用比色法测肌肉CaN活性、同位素法测肌肉GSK-3活性。【结果】1.耐力运动和高脂膳食对比目鱼肌基础P-Akt（Ser473）和趾长伸肌基础P-S6K1（Thr389）蛋白含量增加有交互影响。耐力运动增加高脂膳食时比目鱼肌基础P-Akt（Ser473）和趾长伸肌P-S6K1（Thr389）蛋白含量,而高脂膳食增加比目鱼肌基础P-S6K1（Thr389）蛋白含量。2.耐力运动和高脂膳食增加趾长伸肌基础胞浆GSK-3蛋白含量,耐力运动降低比目鱼肌基础胞核GSK-3蛋白含量。3.高脂膳食增加比目鱼肌基础胞浆GSK-3活性;耐力运动和高脂膳食对比目鱼肌基础胞核GSK-3活性有交互影响;耐力运动降低趾长伸肌基础胞浆GSK-3活性。4.耐力运动和高脂膳食不影响比目鱼肌基础胞浆和胞核CaN活性;耐力运动增加趾长伸肌基础胞浆CaN活性,而高脂膳食降低其活性。5.耐力运动降低比目鱼肌胞核NFATc1蛋白含量;耐力运动和高脂膳食对趾长伸肌胞核NFATc1蛋白含量有交互影响。耐力运动增加趾长伸肌胞核NFATc1蛋白含量,而高脂膳食损害运动诱导的趾长伸肌胞核NFATc1蛋白增加幅度。【结论】1.耐力运动增加趾长伸肌基础CaN活性,而高脂膳食降低其活性;耐力运动和高脂膳食不影响比目鱼肌基础CaN活性。2.耐力运动和高脂膳食可影响比目鱼肌和趾长伸肌AKt/S6K1/GSK-3信号通路,但具有肌肉特异性。第三章环孢素A对耐力运动大鼠骨骼肌表型及其相关信号通路影响【目的】明确CaN-NFATC1在耐力运动时肌纤维表型改变中的作用,以及它对Akt信号通路的影响。【方法】16只训练大鼠第三周术随机进一步分成二组,其中一组加用环孢素（环孢素运动组,每天于运动前1～2小时皮下注射环孢素A,剂量为15mg/Kg体重）,对照运动组注射等量生理盐水（运动组）。同时以实验一的正常组作为不运动对照组。训练方法同前。第6周末实验结束,取材和测试指标、测试方法同前。【结果】1.环孢素阻碍耐力运动时比目鱼肌慢肌比例的增加（运动组和环孢素运动组MHCI比例分别为93.4±6.0%、79.3±8.4%,P=0.007）,同时显著降低Ⅰ型纤维横断面积（正常组、运动组、环孢素运动组分别为3763.0±386.9、4047.2±201.7、2753.5±244.3μm2,P=0.000）。2.环孢素对无坡度跑台训练大鼠趾长伸肌纤维类型无显著影响,显著降低各型肌纤维横断面积（Ⅰ、Ⅱax和Ⅱb型在正常组、运动组、环孢素运动组分别为1296.8±331.7、1530.5±133.3、902.8±99.2μm2,P=0.001:2436.5±420.4、2587.2±294.8、1797.5±174.5μm2,P=0.002;4694.2±238.7、4345.2±372.8、2527.5±165.8μm2,P=0.000）,但增加趾长伸肌相对质量和肌原纤维蛋白浓度。3.环孢素不影响耐力运动时比目鱼肌和趾长伸肌基础P-Akt（Ser473）总含量,也不影响耐力运动时胞浆和胞核GSK-3蛋白含量和活性,但升高耐力运动时趾长伸肌P-S6K1（Thr389）含量。【结论】1.环孢素阻碍耐力运动时比目鱼肌纤维转换,并降低耐力运动时肌纤维的横断面积。2.环孢素不影响耐力运动时骨骼肌总P-Akt（Ser473）含量和GSK-3活性变化。全文结论1.CaN通路参与了耐力运动诱导的肌纤维转换。2.CaN通路参与调节肌纤维横断面积,且环孢素反使耐力运动时快肌肌原纤维蛋白浓度增加。3.AKt/S6K1/GSK-3信号通路与耐力运动、高脂膳食时骨骼肌质量和纤维大小改变相关联,并具有肌肉特异性。4.CaN不影响耐力运动时骨骼肌总P-Akt（Ser473）含量和GSK-3活性变化。