精子处理方法及β-巯基乙醇对牛体外受精的影响

论文摘要

体外受精是一项在基础研究和应用研究领域都有着广泛应用的技术。体外受精技术在研究受精和合子早期发育机理、治疗人类不育症及提高家畜尤其是奶牛和肉牛生产力方面有重要作用。但其相对较低的生产效率和稍差的胚胎和胎儿生存能力阻碍了体外受精技术在奶牛和肉牛产业中的广泛应用。本试验旨在通过以下几个方面的研究进一步完善牛体外受精胚胎生产体系,主要结果如下：1.体外高氧环境下培养的卵母细胞和胚胎会产生过量的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）,从而对细胞造成损伤,ROS被认为是体外胚胎生产效率低下的主要原因之一。β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol,β-ME）是一种低分子量的硫醇类物质,添加到细胞培养液中可以促进细胞内谷胱甘肽（Glutathione, GSH）的合成而降低ROS对细胞的损伤。试验研究了在成熟液和胚胎培养液中添加β-ME对牛卵母细胞体外成熟、受精、早期胚胎发育的影响,结果表明：（1）在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加0μM（对照）、50μM和100μM的p-ME,随着β-ME浓度的升高卵母细胞的成熟率有提高的趋势,但三组间无显著差异（P>0.05）。在卵裂率方面三个试验组间也无显著差异（P>0.05）。（2）在成熟液和胚胎培养液中添加0μM（对照）、50μM和100μM的β-ME对囊胚率无显著影响（P>0.05）。50μM和100μM组胚胎的发育速度显著高于对照组,但两试验组之间差异不显著（P>0.05）。因此,研究认为牛卵母细胞体外成熟液中添加β-ME,随着β-ME浓度的提高,其对成熟率有提高的趋势,对卵裂率和囊胚率无显著影响,但显著提高了胚胎发育速度。2.研究了不同的精子纯化获能方法、精卵共孵育时间和公牛品种对体外受精的影响,结果表明：（1）试验研究了Percoll法和BO液上浮法两种精子分离纯化获能方法对体外受精结果的影响。Percoll法为用Percoll密度梯度离心法分离纯化冻精并接着用以TALP为基础液的受精液受精卵母细胞；BO上浮法为用BO上浮液分离纯化精子并用以BO受精液受精卵母细胞。两种方法对比,Percoll法能显著提高IVF的卵裂率（P<0.05）,但二者在囊胚率方面无显著差异（P>0.05）。（2）试验分别应用两头荷斯坦奶牛冻精与两头肉牛（利木赞和西门塔尔）冻精对本地黄牛卵母细胞进行体外受精,两种冻精相比,荷斯坦奶牛的冻精显著提高了卵母细胞的体外卵裂率（P<0.05）,但二者在囊胚率方面差异不显著（P>0.05）。（3）试验分别研究了不同长度的体外精卵共孵育时间对体外受精结果的影响。结果表明,精卵共孵育9h和12h与对照组6h相比能显著提高卵裂率（P<0.05）,但三者在囊胚率方面无显著差异（P>0.05）。因此,研究认为,应用Percoll法分离纯化精子并用TALP受精液受精卵母细胞能获得更高的卵裂率；在本试验条件下,9h的精卵体外孵育时间已经能够获得良好的卵裂率和囊胚率；荷斯坦奶牛冻精比肉牛（利木赞和西门塔尔）冻精能获得更好的体外受精效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 牛体外受精技术研究进展
• 1.1 精子获能的研究进展
• 1.1.1 精子获能和顶体反应的条件和机理
• 1.1.2 牛精子获能的调控因素
• 1.2 精子的纯化与获能
• 1.2.1 精子的纯化
• 1.2.2 精子体外获能的主要途径
• 1.2.3 影响体外受精的因素
• 2 β-巯基乙醇在IVP应用中的研究进展
• 2.1 体外培养时ROS的产生
• 2.1.1 体外氧浓度
• 2.1.2 金属阳离子
• 2.1.3 可见光
• 2.1.4 胺氧化酶
• 2.2 ROS的生物学意义
• 2.3 ROS的清除
• 2.4 ROS与胚胎发育阻滞的关系
• 2.5 添加抗氧化剂克服胚胎发育阻滞现象
• 3 牛体外生产胚胎移植的研究进展
• 3.1 体外生产胚胎的前景
• 3.2 IVF胚胎移植研究进展
• 3.3 SCNT胚胎移植研究进展
• 3.4 小结
• 4 研究的目的和意义
• 第二章 试验研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 主要试验设备
• 1.1.2 主要试剂和药品
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 卵巢的获得
• 1.2.2 卵母细胞的收集
• 1.2.3 卵母细胞的筛选与分级
• 1.2.4 卵母细胞的成熟培养
• 1.2.5 卵母细胞成熟判定
• 1.2.6 卵母细胞受精前的准备
• 1.2.7 精子的纯化与体外获能
• 1.2.8 卵母细胞的体外受精
• 1.2.9 受精卵的体外培养
• 1.2.10 胚胎移植
• 2 试验方案
• 2.1 试验设计
• 2.2 统计学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 β-ME对牛卵母细胞体外成熟的影响
• 3.2 不同精子纯化、获能方法对卵裂率和囊胚率的影响
• 3.3 肉牛（利木赞和西门塔尔）和奶牛（荷斯坦）冻精对体外受精效果的影响初探
• 3.4 不同精卵共孵育时间对体外受精效果的影响
• 3.5 成熟液和胚胎培养液中添加不同浓度β-ME对体外受精效果、胚胎发育速度的影响及胚胎移植初探
• 4 讨论
• 4.1 β-ME对牛卵母细胞体外成熟及卵裂率、囊胚率和胚胎发育速度的影响
• 4.2 精卵共孵育时间对体外受精结果的影响
• 4.3 公牛品种对体外受精结果的影响的初探
• 4.4 精子分离纯化及受精方法对体外受精结果的影响
• 5 小结
• 参考文献
• 附表
• 附图
• 致谢