论文摘要
艰难梭菌（Clostridium difficile）为革兰染色阳性产芽孢厌氧杆菌,可引起抗菌药物相关性腹泻及假膜性肠炎（Pseudomembranous colitis, PMC）,统称为艰难梭菌相关性腹泻（Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD）。近十年来,由于艰难梭菌毒力的改变,尤其是艰难梭菌高毒株027及078的流行,北美和欧洲艰难梭菌感染发病率和死亡率显著上升。艰难梭菌是医院获得性腹泻的最主要病原菌。虽然目前国内没有全国性的监测资料,但对局部地区的研究显示国内CDAD并不少见,发病率约为15-17例次/10000住院病人,与国外非暴发流行期发病率相仿。CDAD特别是复发性感染的治疗方案数十年来进展不大,迄今为止仍是医学界的难题。欧洲ESCMID及美国IDSA发布艰难梭菌指南推荐的主要治疗用药仍然是甲硝唑及万古霉素,但已有有效率降低且复发率增高的报道,同时万古霉素耐药肠球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus, VRE）较高的检出率也限制了万古霉素的应用。美国FDA2011年新批准的非达霉素对艰难梭菌具有良好的抗菌活性,然其价格昂贵,且目前国内没有上市。其他治疗方法,如服用益生菌甚至正常人粪便灌肠等重建肠道正常菌群有一定疗效,毒素吸附剂的作用仍有争议,而免疫治疗如单克隆抗体和疫苗还处于研究阶段。因此寻找新的治疗方案就成为当务之急。小檗碱（黄连素,Berberine, Ber）是从黄连等植物中提取的一种异喹啉类生物碱。黄连用于治疗腹泻在中国已有数千年历史。有报道显示小檗碱在体外对多种革兰氏阳性菌和阴性菌有抑制或杀灭作用,并可减少细菌毒素的释放,在体内对小鼠肠道损伤亦具有保护作用。此外有研究报道小檗碱与苯唑西林具有协同抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）作用。基于上述背景提出本课题。本课题将应用多种研究方法对小檗碱单用或联合万古霉素对艰难梭菌的体内和体外抗菌活性进行研究,以期为艰难梭菌腹泻的治疗提供新的方向。课题研究分以下两部分：一、小檗碱单用或联合万古霉素对艰难梭菌的体外抗菌活性研究。二、小檗碱单用或联合万古霉素在金黄地鼠艰难梭菌相关性腹泻模型中的疗效。第一部分小檗碱单用或联合万古霉素对艰难梭菌的体外抗菌活性研究收集2008至2009年复旦大学附属华山医院临床分离的50株艰难梭菌,采用琼脂稀释法测定小檗碱与万古霉素对50株艰难梭菌临床分离株的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）;采用棋盘法对该50株菌株进行体外联合药敏测定,并选取部分有协同或相加作用的菌株用E-test方法进行验证。选取1株万古霉素耐药临床株SH9、1株万古霉素敏感性下降临床株SH178、1株标准菌株艰难梭菌ATCC 43596c、1株瑞典临床株（核糖核酸型027）,采用菌落计数法进行小檗碱（64 mg/L和128 mg/L）和万古霉素单药（1/2 MIC-2 MIC）及联合用药的体外杀菌实验,绘制杀菌曲线。利用相差显微镜计算小檗碱和万古霉素单药（1/4 MIC-2 MIC）及联合用药后艰难梭菌产芽孢率。小檗碱单药对艰难梭菌的MICso为512mg/L, MIC90为>512 mg/L；万古霉素单药对艰难梭菌的MIC5o为0.5mg/L, MIC90为1 mg/L,其中有3株菌对万古霉素呈耐药（MIC=4 mg/L）。小檗碱和万古霉素联用对50株艰难梭菌呈协同、相加、无关作用的菌株分别为12%、80%、8%,未发现有拮抗作用菌株,E-test法结果与棋盘法结果基本一致。体外杀菌曲线结果示两药不同浓度联合对临床株027、SH9及SH178菌株多呈相加作用,对标准菌株艰难梭菌ATCC 43596c呈无关作用。与万古霉素单药相比,小檗碱与万古霉素联合用药可降低艰难梭菌产芽孢率。上述结果显示小檗碱单用对艰难梭菌抗菌活性较弱,与万古霉素联合对艰难梭菌多呈相加作用；小檗碱与万古霉素联合用药较万古霉素单药产芽孢率低。第二部分小檗碱单用或联合万古霉素在金黄地鼠艰难梭菌相关性腹泻模型中的疗效建立克林霉素诱导的金黄地鼠艰难梭菌腹泻模型,并对小檗碱单用或联合万古霉素对金黄地鼠艰难梭菌相关性腹泻的疗效进行评价。实验菌株为艰难梭菌高毒株027菌株；实验动物为金黄地鼠,雌性,体重80g左右,31只,分5组：小檗碱单药组（7只）,万古霉素单药组（7只）,小檗碱与万古霉素联合用药组（7只）,不给药对照组及健康对照组（各5只）。急性感染观察期至给予艰难梭菌（灌胃）后第7天,观察终点为给予艰难梭菌后第27天,观察金黄地鼠大便性状、体重改变,比较不同组别的存活率,绘制生存曲线。濒死地鼠及观察终点仍存活地鼠乙醚麻醉处死后解剖取结肠及盲肠组织HE染色,并取肠内容物进行细菌培养及鉴定。金黄地鼠健康对照组实验全程无腹泻,体重无下降,至观察终点无死亡。不给药对照组艰难梭菌灌胃后1-2天全部出现腹泻症状,至第3天全部死亡,体重减轻19.9%±8.6%。小檗碱单药组艰难梭菌灌胃后1-2天全部出现腹泻症状,至第3天全部死亡,体重减轻14.1%±6.4%。万古霉素单药组艰难梭菌灌胃后1-2天部分出现腹泻症状,感染后存活者第4-5天腹泻好转,至初次感染观察终点体重下降-2.4%±5.8%,初次感染存活率57.1%,复发率为75%,至第27天总存活率为14.3%。小檗碱与万古霉素联合用药组在给予艰难梭菌灌胃后1-2天部分出现腹泻症状,感染后存活者第4-5天腹泻好转,初次感染观察终点体重下降约1.1%±5.3%,初次感染存活率为71.4%,复发率为20%,至第27天总存活率为57.1%。取所有金黄地鼠的结肠内容物做艰难梭菌培养、毒素检测及Ribotyping基因分型,均为实验菌株。各组别之间结肠组织病理学损伤无显著差异。上述结果显示虽然小檗碱单药对金黄地鼠CDAD疗效差,但小檗碱与万古霉素联合用药可降低金黄地鼠CDAD复发率,提高总存活率。综上所述,本课题研究结果显示：1.小檗碱单用对艰难梭菌体外及体内抗菌活性弱；2.小檗碱与万古霉素联合用药对艰难梭菌呈相加作用；3.小檗碱与万古霉素联合用药较万古霉素单药产芽孢率低；4.小檗碱与万古霉素联合用药可降低金黄地鼠CDAD复发率,提高存活率。本课题在国内外首次对小檗碱单用或联合万古霉素对艰难梭菌体外与体内抗菌作用进行了系统评价,为今后CDAD提供了新的临床治疗方向,改善预后减少复发。如今后能经过符合GCP规范的临床试验验证,就有可能将小檗碱这一传统中药像青蒿素一样推向国外市场,具有重要的社会意义及经济效益。本课题研究中诱导金黄地鼠CDAD模型的试验菌株较少,此为研究中不足之处,有待于今后累积更多的实验资料以进一步评价。