绵羊CCL28和Granulysin基因的克隆与体外表达

论文摘要

CC趋化因子配体28（CCL28）,又称黏膜相关上皮趋化因子（MEC）,是新近发现的CC趋化因子家族成员,在人和小鼠的大部分黏膜组织（唾液腺、乳腺、小肠、大肠和气管）中表达,并且是由以上组织的上皮细胞产生。CCL28对IgA抗体分泌细胞（IgA-ASCs）的归巢起重要作用,此外,CCL28还具有广谱的抗微生物活性。Granulysin是一种表达于人体细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK Cells）中的一种抗菌蛋白,属于SAPLIP（saposin-like protein）家族的一类脂封闭蛋白,是目前CTL胞浆颗粒中唯一证实具有抗菌活性的效应分子。Granulysin能与穿孔素和颗粒酶共同定位于人的细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞颗粒中,其作用相当于广谱抗菌素,作用范围包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和寄生虫,Granulysin也能杀灭人的肿瘤细胞。为了研究CCL28和Granulysin在绵羊体内是否具有同样的功能,我们克隆了绵羊CCL28和Granulysin基因,并得到了相应的融合蛋白,试验分两个系列。一、绵羊CCL28基因的克隆与体外表达。利用同源序列克隆原理设计一对克隆引物,对绵羊结肠黏膜组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化Ecol.JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析;又根据克隆序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHI/XhoI酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coli BL21,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框架,长为444bp,ORF为387bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪和牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推导的氨基酸序列与人、小鼠、猪和牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,信号肽为124aa,SCY功能域为2788aa,结构特征与人、小鼠、猪和牛的CCL28相一致,成功构建了原核表达载体pGEX-CCL28,表达的融合蛋白分子量约为39ku,为进一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定了基础。二、绵羊Granulysin基因的克隆与体外表达。基于电子延伸序列,设计一对克隆引物,对绵羊回肠黏膜组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化Ecol.JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析;又根据克隆序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆质粒中扩增出含BamHI/XhoI酶切位点的Granulysin片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-Granulysin,转化宿主菌E.coli BL21,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊Granulysin基因包含完整的开放阅读框架,长为509bp,ORF为438bp,编码146个氨基酸,与人和牛该基因的同源性分别为56.2%和87.2%,推导的氨基酸序列与人和牛的同源性分别为38%和75%,信号肽为122aa,SapB功能域为64138aa,结构特征与人和牛的Granulysin相一致,成功构建了原核表达载体pGEX-CCL28,表达的融合蛋白分子量约为41 ku,为进一步研究绵羊Granulysin的生物学功能奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 趋化因子CCL28 的研究进展
• 1.1.1 CCL28 的结构
• 1.1.2 CCL28 的表达
• 1.1.3 CCL28 的受体
• 1.1.4 CCL28 的功能
• 1.2 Granulysin 的研究进展
• 1.2.1 Granulysin 的结构
• 1.2.2 Granulysin 的基因表达及生物合成
• 1.2.3 Granulysin 的作用机制
• 1.2.4 Granylysin的功能
• 1.3 展望
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 绵羊CCL28 基因的克隆与体外表达
• 3.1.1 样品采集
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 克隆与序列分析
• 3.1.5 原核表达载体pGEX-CCL28 的构建
• 3.2 绵羊Granulysin 基因的克隆与体外表达
• 3.2.1 样品采集
• 3.2.2 菌株和质粒
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 克隆与序列分析
• 3.2.5 原核表达载体pGEX-Granulysin 的构建
• 4 结果与分析
• 4.1 绵羊CCL28 基因的克隆与体外表达
• 4.1.1 克隆与序列分析
• 4.1.2 原核表达与鉴定
• 4.2 绵羊Granulysin 基因的克隆与体外表达
• 4.2.1 克隆与序列分析
• 4.2.2 原核表达与鉴定
• 5 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 绵羊CCL28 基因的克隆与体外表达
• 5.1.2 绵羊Granulysin 基因的克隆与体外表达
• 5.2 结论
• 参考文献
• 英文摘要
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 攻读硕士期间在 GenBank 上注册的基因号