凡纳滨对虾性腺抑制激素基因的克隆与表达

论文摘要

性腺抑制激素（gonad inhibiting hormone,GIH）是甲壳动物X-器官—窦腺复合体分泌的一种神经内分泌多肽类激素,对雌、雄个体的性腺发育、蜕皮及甲基法尼酯（methyl farnesoate,MF）的分泌均有抑制作用。本文以性腺发育成熟的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象,利用RACE技术克隆获得GIH基因cDNA片段（含3’UTR）,预测GIH基因编码的氨基酸序列,并利用生物信息学方法进行分析;利用半定量RT-PCR方法检测凡纳滨对虾八个不同发育时期（受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾25天、仔虾30天、仔虾35天和仔虾40天）,以及雌雄成体不同组织（肌肉、脑、眼柄、胃肠、鳃、心脏、卵巢和精巢）中的表达,并检测了环境内分泌干扰物壬基酚（nonylphenol,NP,100μg/L和0.01μg/L）对凡纳滨对虾雌虾眼柄中GIH基因表达的影响。结果表明:凡纳滨对虾GIH cDNA片段长为683bp,其中3’非编码区（3’UTR）为518bp,可读编码框162bp,编码54个氨基酸,在Poly（A）尾前15bp处存在AATAAA加尾信号。凡纳滨对虾GIH与斑节对虾相似性最高,达到96%,与刀额新对虾相似性为72%。通过与Genbank上已知氨基酸序列进行蛋白比对,发现凡纳滨对虾GIH中具有CHH蛋白家族共有的4个保守的半胱氨酸残基。凡纳滨对虾GIH基因在受精卵、幼体发育阶段及仔虾时期的眼柄中均有表达,35天时达到最高值（0.936±0.021）,且与其他各期存在显著性差异（P<0.05）,幼体发育阶段GIH表达量显著高于受精卵期（P<0.05）,仔虾时期GIH表达量显著高于幼体阶段（P<0.05）;在凡纳滨对虾雌、雄个体不同组织中,仅在眼柄和脑处检测到GIH基因的表达,表明凡纳滨对虾GIH基因与神经活动有关;NP处理抑制凡纳滨对虾雌性个体眼柄中GIH基因的表达且存在一定的剂量依存关系,但抑制效果不显著（P>0.05）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 X-器官—窦腺复合体
• 1.1.1 X-器官—窦腺复合体的超微结构
• 1.1.2 X-器官—窦腺复合体分泌的激素及其生理功能
• 1.2 性腺抑制激素（GIH）的国内外研究现状及发展动态
• 1.2.1 性腺抑制激素（GIH）的理化性质
• 1.2.2 性腺抑制激素（GIH）的组织分布
• 1.2.3 性腺抑制激素（GIH）的功能及作用机理
• 1.3 环境内分泌干扰物对甲壳动物性别分化相关基因的影响
• 1.4 凡纳滨对虾的生物学特征及研究现状
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 凡纳滨对虾性腺抑制激素（GIH）片段cDNA 及3’UTR 的克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 凡纳滨对虾眼柄总RNA 的提取
• 2.2.2 GIH cDNA 中间片段及 3’UTR 扩增结果
• 2.2.3 转化菌落的PCR 鉴定
• 2.2.4 凡纳滨对虾GIH 片段cDNA 序列分析
• 2.2.5 进化树分析
• 2.3 讨论
• 3 GIH m RNA 的时空表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 Litβ-actin 的RT-PCR 扩增结果及序列分析
• 3.2.2 循环数对PCR 产物灰度的影响
• 3.2.3 凡纳滨对虾雌雄成体各组织中GIH m RNA 的表达
• 3.2.4 凡纳滨对虾早期发育不同时期GIH m RNA 的表达
• 3.3 讨论
• 4 壬基酚干扰对凡纳滨雌虾眼柄性腺抑制激素（GIH）m RNA 表达水平的效应
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介