首页> 正文

调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析

2020-11-29阅读(260)

调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析

论文摘要

玉米大斑病的控制始终是玉米生产上的一个重要问题,而控制玉米大斑病危害的一个重要前提是要了解其致病过程。玉米大斑病菌的致病过程是玉米大斑病菌和寄主玉米相互识别、相互作用的过程,研究这一特异互作过程中的信号转导机制对深入了解玉米大斑病菌的致病机理,设计新型杀菌剂,提出新的植物病害控制策略具有重要意义。本论文主要研究了Ca2+信号转导途径对玉米大斑病菌分生孢子形态构建及致病性的调控作用。本文首先利用Ca2+信号转导途径特异性抑制剂确定了Ca2+信号转导途径与玉米大斑病菌的孢子萌发、附着胞形成和致病性相关。研究发现,钙调素抑制剂TFP和钙调磷酸酶抑制剂CsA处理分生孢子,随着浓度的增加,对孢子萌发和附着胞形成过程的抑制作用明显增强;同一浓度下,抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌发过程,抑制剂可使附着胞明显变小甚至不能形成,以上结果表明钙信号传导途径参与了玉米大斑病菌孢子萌发及疏水条件下附着胞形成过程的调控。根据已知植物病原真菌钙调素（CaM）氨基酸序列保守区域设计简并引物,以玉米大斑病菌cDNA为模板,通过PCR技术获得CaM基因的同源片段,利用SMART-RACE技术获得了CaM的cDNA全长序列。并根据CaM基因cDNA全长序列设计基因特异性引物扩增玉米大斑病菌基因组DNA获得了该基因DNA全长。利用BLASTX软件与GenBank中已知蛋白进行同源性分析,发现该开放阅读框所编码的氨基酸序列与许多真菌如水稻胡麻斑（Cochliobolus miyabenus）、小麦颖枯病菌（Phaeosphaeria nodorum）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）等的钙调素基因的相似性为95%～100%。因此,初步推测该序列为玉米大斑病菌钙调素基因CaM,所获得的cDNA序列已提交GenBank（登录号为EF010936）。玉米大斑病菌CaM基因DNA全长776 bp,cDNA全长450 bp,编码149个氨基酸,有4个内含子,试验中发现的所有内含子均符合GT-AG法则。利用genomic walking技术获得CaM基因启动子序列,用Proscan在线软件对启动子序列进行分析,发现该序列含有多个与转录调控有关的保守序列（如TATA-box、Sp1、AP-2和TFIID）。Southern杂交结果表明,玉米大斑病菌的CaM基因在基因组中以单拷贝形式存在。为了研究钙调素基因对大斑病菌致病性的调控作用,构建了玉米大斑反义诱导表达载体,并对它们的正确性进行了酶切验证。利用PEG介导的转化系统将构建好的含有潮霉素抗性筛选标记的反义表达载体转化到玉米大斑病菌原生质体中,获得了14个抗性转化子,这些转化子能在潮霉素抗性平皿上连续继代培养。通过使用设计的潮霉素磷酸转移霉基因特异性引物和分子杂交进行筛选,得到了2个CaM基因反义表达突变体。在奎宁酸诱导条件下,玉米大斑病菌CaM基因反义表达突变体分生孢子萌发率降低,分生孢子萌发后形成的附着胞多为畸形并且黑色素沉积减少,提取的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显著下降。利用候选基因法克隆了钙调素下游的钙调磷酸酶A亚基、钙调素依赖性蛋白激酶基因。钙调磷酸酶A亚基编码525个氨基酸,利用BLASTX软件与GenBank中已知蛋白进行同源性分析发现,所编码的氨基酸序列与许多真菌如小麦颖枯病菌（P.nodorum）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）等的钙调磷酸酶基因的相似性为860%～94%。因此,初步推测该序列为玉米大斑病菌钙调磷酸酶基因CNA,所获得的cDNA序列已提交GenBank,序列登陆号为（EF407562）。该基因内部含有6个内含子,分别为116bp、47bp、47bp、47bp、47bp和49bp。玉米大斑病菌中钙调素依赖性的蛋白激酶有4个不同亚型,通过RACE技术已经克隆出3个钙调素依赖性的蛋白激酶基因的全长,而第4个仅得到部分片段。所获得的cDNA序列已提交GenBank,序列登陆号分别为（EU605885,EU605886,EU605887）。4个不同亚型的钙调素依赖性的蛋白激酶都含有蛋白激酶ATP结合位点和活性位点保守基序。信号转导途径对玉米大斑病菌孢子形态构建及致病性发挥着重要调控作用。抑制剂实验和钙调素基因反义抑制实验均表明钙调素基因对于玉米大斑病菌形成正常附着胞是重要的,同时钙调素也调控着毒素的合成。而玉米大斑病菌钙信号传导途径的重要组分钙调素依赖的磷酸酶、激酶基因的克隆,为后续认识玉米大斑病菌钙信号途径奠定基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 第一章 玉米大斑病菌CaM基因的克隆
  • 1 功能基因克隆策略
  • 2 利用基因组作图和测序进行基因克隆
  • 第一节 玉米大斑病菌CaM基因同源片段的获得
  • 1 材料和方法
  • 2 结果与分析
  • 第二节 玉米大斑病菌CaM基因cDNA全长的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2 结果与分析
  • 第三节 CaM基因全长DNA序列的获得
  • 1 材料和方法
  • 2.结果和分析
  • 第四节 CaM基因启动子序列的获得
  • 1 材料和方法
  • 2.结果和分析
  • 第五节 CaM基因的拷贝数分析
  • 1 材料和方法
  • 2.结果与分析
  • 2+途径特异性抑制剂分析'>第六节 Ca2+途径特异性抑制剂分析
  • 1.材料与方法
  • 2.结果与分析
  • 第七节 本章讨论
  • 第二章 玉米大斑病菌CaM正义、反义表达载体的构建及反义转化子的筛选
  • 第一节 玉米大斑病菌CaM正义、反义表达载体的构建
  • 1 材料和方法
  • 2 结果和分析
  • 第二节 玉米大斑病菌（正义反义）遗传转化及转化子的筛选
  • 1 材料和方法
  • 2.结果和分析
  • 第三节 玉米大斑病菌CaM基因反义转化子的生物学特征
  • 1 材料和方法
  • 2.结果和分析
  • 第四节 本章讨论
  • 第三章 玉米大斑病菌CaM下游基因的克隆
  • 第一节 玉米大斑病菌钙调磷酸酶A亚基基因的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2.结果与分析
  • 第二节 玉米大斑病菌钙调素依赖性蛋白激酶CAK1基因的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2.结果与分析
  • 第三节 玉米大斑病菌钙调素依赖性蛋白激酶CAK2基因的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2.结果与分析
  • 第四节 玉米大斑病菌钙调素依赖性蛋白激酶CAK3基因的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2.结果与分析
  • 第五节 玉米大斑病菌钙调素依赖性蛋白激酶CAK4基因的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2.结果与分析
  • 第六节 本章讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录:灰葡萄孢CaM基因的克隆与功能分析
  • 第一节 灰葡萄孢CaM基因cDNA全长和DNA全长的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2.结果与分析
  • 第二节 灰葡萄孢CaM基因启动子的克隆
  • 1 材料和方法
  • 2.结果和分析
  • 第三节 灰葡萄孢CaM基因拷贝数验证与正反义表达载体构建
  • 1 材料和方法
  • 2 结果和分析
  • 第四节 灰葡萄孢CaM反义表达载体转化与突变体筛选
  • 1 材料和方法
  • 2.结果和分析
  • 第五节 灰葡萄孢CaM基因反义转化子的生物学特征
  • 1 材料和方法
  • 2.结果和分析
  • 第六节 本章讨论
  • 在读期间发表的学术论文
  • 作者简历
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].智能制造趋势下少数民族地区高职“CAM技术”课程建设研究[J]. 南方农机 2020(11)
    • [2].CAM环境下飞机结构件加工刀具及切削参数自动推送技术研究[J]. 制造技术与机床 2020(10)
    • [3].数控冲床CAM系统的研究与开发[J]. 机床与液压 2017(01)
    • [4].对数控加工中CAM软件应用的几点探讨[J]. 中国战略新兴产业 2017(20)
    • [5].化工设计过程中CAM的应用[J]. 化工管理 2015(34)
    • [6].集成于CAM的经编制造执行系统的设计与实现[J]. 上海纺织科技 2019(12)
    • [7].基于高速切削CAM编程问题及对策探析[J]. 装备制造技术 2012(09)
    • [8].水蛭对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响[J]. 中医学报 2011(04)
    • [9].CAM后置处理技术现状与发展趋势[J]. 机械 2009(12)
    • [10].基于宏程序功能与CAM软件实现动态加工[J]. 制造技术与机床 2014(05)
    • [11].肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建[J]. 现代生物医学进展 2009(17)
    • [12].磨牙牙冠的模型重构与CAM工艺[J]. 华南理工大学学报(自然科学版) 2010(05)
    • [13].CaM及各亚型基因参与小麦抗叶锈病反应的研究[J]. 华北农学报 2010(04)
    • [14].基于CAM技术的电蚊香盖注模成型零件的加工[J]. 模具制造 2015(12)
    • [15].计算机辅助建造技术(CAM)在风景园林规划设计阶段的应用探索[J]. 风景园林 2016(02)
    • [16].三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析[J]. 安徽农业科学 2014(22)
    • [17].CAM软件在数控加工中的应用研究[J]. 机械工程师 2015(04)
    • [18].医用半烧结氧化锆陶瓷在义齿CAM加工中的应用[J]. 现代制造工程 2015(09)
    • [19].宏程序与CAM软件在曲面编程中的应用[J]. 模具制造 2013(11)
    • [20].基于随机森林算法的CAM模板自动提取研究[J]. 模具工业 2017(07)
    • [21].浅析曲面图形数控加工宏程序编程与CAM编程[J]. 电子测试 2013(05)
    • [22].液压支架集成设计平台的CAM子系统开发与研究[J]. 矿山机械 2012(07)
    • [23].高职院校课堂教学质量评价研究——以《机械CAD/CAM应用》课程为例[J]. 产业与科技论坛 2018(11)
    • [24].铁路货车模具生产中CAM技术的运用分析[J]. 科技创新导报 2014(18)
    • [25].水稻不同粒位小穗轴的超微结构差异及其CaM活性的细胞化[J]. 作物学报 2009(12)
    • [26].探讨Cam型髋撞击辐射状层面α角的诊断价值[J]. 临床放射学杂志 2017(04)
    • [27].应力吸收层CAM的级配特征与性能研究[J]. 公路交通科技(应用技术版) 2016(03)
    • [28].对数控加工中CAM软件应用的几点探讨[J]. 技术与市场 2016(06)
    • [29].基于CAM卡实现数字电视用户个性化信息读取管理功能的研究[J]. 深圳信息职业技术学院学报 2013(03)
    • [30].木榄CaM基因的克隆及序列分析[J]. 生物技术通报 2010(12)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2025 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5