慢病毒载体介导的hbFGF基因修饰骨髓间充质干细胞治疗肢体缺血的实验研究

论文摘要

目的探讨以慢病毒为载体介导人碱性成纤维生长因子（human basic fibroblastgrowth factor,hbFGF）基因修饰骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cell,BMSC）治疗肢体缺血的可行性。方法1、采用密度梯度离心方法获取SD（Sprague Dawley）大鼠BMSC，用含有10%胎牛血清的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）作为培养基，获取第3—5代BMSC。2、以慢病毒构建人碱性成纤维生长因子基因载体，转染大鼠BMSC，获取人碱性成纤维生长因子基因修饰BMSC。3、24只SD大鼠均切除右侧股动脉及其分支，形成后肢缺血模型鼠。成模后随机分为4组（每组6只）：bFGF-BMSC组，缺血后肢肌内多点注射bFGF基因修饰的BMSCs；GFP-BMSC组，缺血后肢肌内多点注射携带绿色荧光蛋白（greenfluorescent protein，GFP）空载病毒转染的BMSCs;BMSC组，缺血后肢肌内多点注射普通BMSCs；PBS组，肌内注射与前者等体积的磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer saline，PBS）。4、细胞移植4周后，取内收肌和腓肠肌组织，一部分用于冰冻切片，记数微血管密度并观察移植细胞的改变；另一部分用于western blot实验，检测bFGF、VEGF等在动物体内的表达。结果1、通过密度梯度离心方法，可获得相对纯化的BMSC。2、 BMSCs接受慢病毒转染2d后，在荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光。3、细胞移植2周后，受体动物体内可见绿色荧光阳性细胞，其中GFP-BMSC组，GFP+细胞数（15.4±3.85）个/视野低于bFGF-BMSC组（26.6±3.51）个/视野（t=4.811，P=0.001）4、干细胞在体内分化为血管内皮细胞，但是GFP-BMSC组的GFP+CD31+细胞数（7.0±2.12）/视野低于bFGF-BMSC组（14.0±1.58）/视野（t=5.916，P=0.000）。5、 BMSC组微血管密度为（24.0±4.3）/视野，明显高于PBS组（8.8±4.5）/视野（t=2.65，P=0.017）；GFP-BMSC组（28.6±4.2）/视野，与BMSC组无差异（t=0.8，P=0.434）；bFGF-BMSC组（55.0±16.5）/视野，高于BMSC组（t=5.4，P=0.000）6、实验动物接受细胞移植2周后，在bFGF-BMSC组动物缺血区的肌组织中，能够通过western blot检测到人源性bFGF。结论慢病毒介导的基因修饰细胞可在体内存活，人碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的BMSC，可在受体体内存活并表达人碱性成纤维细胞生长因子，以此促进BMSC在体内分化为血管内皮细胞，促进受体缺血区的血管再生，而不对受体动物产生危害。

论文目录

• 主要英文缩略索引（Main English abbreviation index）
• 中文摘要（Chinese abstract）
• 英文摘要（English abstract）
• 引言（Introdction）
• 材料与方法（Materials and methods）
• 结果 （Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusions）
• 参考文献（References）
• 致谢（Acknowledgements）
• 综述（Review）
• 参考文献（References of the review）