山羊核移植中供体和受体细胞的准备及融合激活参数的研究

论文摘要

核移植技术虽然获得了很大的发展,但至今效率仍然很低,这与核移植过程中具体的技术环节有很大的关系。本实验就山羊体细胞核移植过程中一些容易被忽视的问题进行了研究,旨在提高羊核移植的效率。用切剖法分别在山羊繁殖季节和非繁殖季节收集卵母细胞进行体外成熟,平均每个卵巢收集卵母细胞数分别为 2.82 枚和 3.02 枚,成熟率分别为 57%和 60%,差异均不显著（P>0.05）。在山羊非繁殖季节,分别用切剖法和抽吸法收集卵母细胞进行体外成熟,平均每个卵巢收集卵母细胞数分别为和 3.02 枚和 1.10 枚,成熟率分别为 60%和 81%,差异均显著（P<0.05）。卵巢运输时,分别保存在 15～19℃、20～24℃和 25～30℃,8 h左右带回,收集的卵母细胞体外成熟率为分别 52%、68%和 60%,其中 20～24℃组成熟率显著高于其他两组（P<0.05）。分别用中科院动物所和宁波第二激素厂生产的 FSH/LH 及南京动物激素厂产 HCG 对山羊卵母细胞进行体外成熟,相互间成熟率均无显著差异（P>0.05）。无共培养时,分别用 CR1aa、M199（添加 10%FCS）和 HTF+P1 三种培养基对孤雌胚进行体外培养,卵裂率分别为 71%、44%和 76%,M199 组显著低于其他两组（P<0.05）,三组均未得到囊胚。与颗粒细胞共培养时,分别用 CR1aa、SOFaa 和 HTF+P1 对孤雌胚进行体外培养,卵裂率分别为 75.68%、67.33%和 76.27%,相互间差异显著（P<0.05）,以 HTF+P1 最高;囊胚率分别为 21%、10%和 7%,相互间差异显著（P<0.05）。用成熟的卵母细胞进行核移植,在 250 v 电压,一次电脉冲激活时,分别用 10 μs、20 μs 和 40 μs 的电脉冲时程对重构卵进行电融合,融合后存活率分别为 52%、44%和 37%,相互间差异显著（P<0.05）;卵裂率分别为 50%、56%和 65%,40 μs 组显著高于其他两组（P<0.05）。用 250 v,10 μs 电融合时,分别对重构卵进行 1 次或 2 次电激,两者融合后胚胎存活率（52% vs 21%,P<0.05）、卵裂率差异显著（50% vs 69%,P<0.05）和胚胎获得率均差异显著（26% vs 15%,P<0.05）。核移植后,重构卵分别继续培养 30 min、90 min、3～4 h 和 9～10 h 后进行电融合,9～10 h 组（27%）和3～4 h 组（31%）的融合后死亡率显著低于 30 min 组（49%）和 90 min 组（56%）（P<0.05）;卵裂率 9～10 h 组（68%）显著高于 30 min 组（53%）和 90 min 组（59%）（P<0.05）;胚胎获得率也是 910 h 组（49%）显著高于 30 min（28%）和 90 min 组（24%）（P<0.05）。融合的重构胚用离子霉素激活后,移入含 6-DMAP 的培养液中分别激活 0 h、2h、3h、4h、5 h 和 8～10 h,激活后重构胚卵裂率 2～10 h 的各组间无显著差异（P>0.05）,但均显著高于未用 6-DMAP（0 h）组的卵裂率（P<0.05）。分别以波尔山羊耳成纤维细胞和黄淮白山羊卵丘颗粒细胞为供体进行核移植,重构胚的融合率分别为 42%和 51%,卵裂率分别为 56%和 72%,差异均显著（P<0.05）。以上结果说明,当运输时间为 8 h 左右时,20～24℃的保存温度有利于卵母细胞的

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 文献综述
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 溶液的配制
• 1.4 波尔山羊耳成纤维细胞的培养
• 1.5 黄淮白山羊颗粒细胞的采集与培养
• 1.6 供体细胞的冷冻保存
• 1.7 山羊卵巢的采集和运输
• 1.8 山羊卵母细胞的收集
• 1.9 卵母细胞的体外成熟
• 1.10 卵母细胞体外成熟的检查
• 1.11 卵母细胞的孤雌激活
• 1.12 山羊胚胎体外培养
• 1.13 山羊颗粒细胞共培养
• 1.14 去核针和注射针的制备
• 1.15 固定针的制备
• 1.16 供核体细胞的准备
• 1.17 成熟卵母细胞显微操作前的准备
• 1.18 体细胞核移植
• 1.19 实验设计
• 1.20 统计分析
• 2 结果
• 2.1 不同培养方法对培养山羊耳成纤维细胞的效果
• 2.2 不同季节山羊卵母细胞采集效率的比较
• 2.3 季节对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 2.4 卵母细胞收集方法对卵母细胞收集效率和成熟率的影响
• 2.5 储运温度对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 2.6 不同来源的促性腺激素对卵母细胞成熟的影响
• 2.7 不同培养条件下山羊孤雌胚胎的发育
• 2.8 不同电脉冲时程和脉冲次数对核移植重构卵卵裂率的影响
• 2.9 不同平衡时间对重构卵卵裂率的影响
• 2.10 6-DMAP 激活时间对重构胚卵裂率的影响
• 2.11 供核细胞类型对重构胚胎的融合率和卵裂率的影响
• 3 讨论
• 3.1 供体细胞的选择和培养
• 3.2 不同季节山羊卵母细胞采集效率的比较
• 3.3 季节对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 3.4 卵母细胞收集方法对卵母细胞收集效率和成熟率的影响
• 3.5 储运温度对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 3.6 不同来源的促性腺激素对卵母细胞成熟的影响
• 3.7 不同培养条件下山羊孤雌胚胎的发育
• 3.8 不同电脉冲时程和脉冲次数对核移植重构卵卵裂率的影响
• 3.9 不同平衡时间对重构卵卵裂率的影响
• 3.10 6-DMAP 激活时间对重构胚胎卵裂率的影响
• 3.11 供核细胞类型对重构胚的融合率和卵裂率的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢