毕赤酵母中FLD1启动子调控解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2表达的研究

论文摘要

解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2 （YlLIP2）是一种高活力的脂肪酶,具有重要的工业应用前景。本文克隆了甲醛脱氢酶启动子（PFLD1）基因,并以pPICZαA质粒为基础构建了带有PFLD1启动子和YlLIP2基因的重组质粒,电转化巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） X-33获得重组表达菌株。摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组子,优化重组工程菌的摇瓶发酵条件,同时在10 l发酵罐上对比了不同诱导策略对脂肪酶YlLIP2表达的影响。主要研究内容和结果如下:（1）通过PCR方法从P. pastoris GS115/pPIC9K-Lip2-HIS+中扩增得到PFLD1基因和脂肪酶YlLIP2基因。运用双酶切将PFLD1启动子替代pPICZαA表达载体上的PAOX1启动子,构建新的表达载体pFZα,然后将脂肪酶YlLIP2基因插入该表达载体,并电转化P. pastoris X-33,得到重组菌P. pastoris X-33/pFZα-Lip2。（2）对重组子进行三次罗丹明B平板筛选,得到308个有橄榄油水解圈的重组子。摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组子,得到一株最高活力达672 U/ml的83#工程菌。对83#重组子进行了最适碳源和氮源筛选,以甲醇为碳源和诱导物,83#重组子在诱导72 h后发酵液中酶活力为2,450 U/ml;以山梨醇和甲胺盐酸盐（MA?HCl）分别作为碳源和诱导物,发酵72 h后酶活力为2,115 U/ml。两种培养条件下83#重组子发酵的YlLIP2酶活力分别是优化前的3.65倍和3.15倍。检测了83#重组子细胞内的脂肪酶酶活力,为147.86 U/ml,仅为发酵上清的6.4 %,而野生菌株X-33胞内只有本底酶活力7.77 U/ml。（3） 10 l发酵罐上对比了MA?HCl和甲醇两种诱导策略。MA?HCl诱导发酵用时75.34 h,最高细胞干重达59.08 g/l,最高酶活达8,400 U/ml,最高蛋白含量为2.2 g/l,最高蛋白质比酶活达3871 U/mg;甲醇诱导发酵用时146.47 h,最高细胞干重达115.73 g/l,最高酶活达15,600 U/ml,最高总蛋白质含量达6.4 g/l,最高蛋白质比酶活达4,075 U/mg。MA?HCl和甲醇两种诱导策略对比发现,前者发酵时间是后者的51.34 %,单位时间发酵酶活为111.49 U/（ml·h）,而后者的为108.95 U/（ml·h）;前者的单位干细胞酶活力14.79 U/mg,而后者为14.03 U/mg。前者的能耗成本比后者低大约50 %。此外,前者发酵所含色素比后者低,更利于后续纯化。本文研究了PFLD1启动子对毕赤酵母发酵生产脂肪酶YlLIP2的影响,在摇瓶和10 l发酵罐水平均获得很高的表达量,为进一步开发和完善PFLD1启动子诱导表达外源蛋白,以及替代毕赤酵母表达系统中PAOX1启动子奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 脂肪酶的概述
• 1.2 脂肪酶的应用
• 1.3 重组脂肪酶在微生物中的表达
• 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.5 解脂耶氏酵母脂肪酶YlLIP2 的研究进展
• 1.6 本研究课题目的和意义
• 2 PFLD1 启动子调控下YlLIP2 脂肪酶重组菌的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 3 高产酶菌株筛选及摇瓶产酶条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 4 发酵罐发酵生产YlLIP2 脂肪酶的初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 5 小结与展望
• 5.1 小结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间发表论文目录
• 附录2 PFLD1 启动子序列和Lip2 基因序列