论文摘要
微流控芯片因其高集成度、便携性、最低限度的样品与试剂消耗、高性能以及快速的特点而引起了研究人员越来越多的关注。蛋白酶解是蛋白质组学研究中质谱鉴定前的一个关键步骤。因为在溶液中进行的传统酶解方法非常耗时,且蛋白酶的自溶作用会产生干扰碎片,所以开发新的方法以达到基于质谱的肽谱法所需的蛋白高效酶解是很重要的。在过去十年中,研究人员通过将各种蛋白酶固定在微流控芯片的微通道中来制备蛋白酶解反应器,再将这些反应器与质谱联用以实行低水平蛋白的高效酶解与灵敏的肽鉴定。固定在微通道中的酶与溶液中的游离酶相比更加稳定,且能够提供酶与蛋白质底物之间分子水平的相互作用。更重要的是,蛋白酶的白溶作用和酶解产物中的干扰碎片都被降到了最低。本文开发了三种基于微流控芯片的新型蛋白酶解反应器。与MALDI-TOF MS联用后的测定结果表明,这三种蛋白酶解方案都简单高效,不仅鉴定结果与传统的酶解方法相比毫不逊色,而且酶解时间大大缩短,它们必将在高通量蛋白质的自动化分析中找到广泛的应用。第一章概括介绍了用于蛋白酶解与鉴定的微流控蛋白酶解反应器的最新进展与关键步骤。内容包括微流控系统的加工、微通道中蛋白酶的固定化、微流控蛋白酶解反应器的典型应用以及对未来的展望。第二章提出了一个基于纤维的微流控芯片蛋白酶解反应器。在微流控芯片通道中含有硅胶涂层的玻璃纤维核心上固定化胰蛋白酶,形成了一个可换芯的新型蛋白酶解反应器,通过替换纤维核心它可以得到再生。用胰蛋白酶酶解了牛血清白蛋白（BSA）和细胞色素C （Cyt-c）来证明这一独特的生物反应器的可行性与性能。酶解产物用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）来鉴定,得到的结果完全可与传统的溶液中胰蛋白酶酶解方法相媲美,但酶解时间却大大缩短到了10s以内。第三章提出了一个基于微流控芯片的蛋白酶解新技术。将一对铂金属丝电极插入一个聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微芯片的主通道中来实现交流电加速的芯片上蛋白酶解。用锉刀将微芯片进样通道的两个终端都削成锐利的进样尖端,在真空吸盘的辅助下经由芯片末端的检测池将蛋白质和胰蛋白酶溶液吸入到含电极的主通道中。蛋白质溶液在通道中与胰蛋白酶溶液混合后,在交流电的存在下快速被酶解。酶解产物用质谱来鉴定,得到的结果完全比得上传统的溶液中胰蛋白酶酶解方法,而酶解时间却从传统方法所需的12 h显著缩短到了本方法所需的4 min。第四章提出了一个利用血压计球驱动的微流控芯片蛋白酶解反应器,用于红外线加速的蛋白高效酶解。这个新型的蛋白酶解系统主要包括一个血压计球驱动系统,一个单十字交叉的PMMA微流控芯片和一个温度可控的红外线放射系统。利用一个血压计球产生的压强来推动蛋白质和胰蛋白酶溶液经由两个毛细管和微流控芯片的进样通道流进主通道中。两种溶液在主通道中混合后,在红外线的照射下蛋白质快速被胰蛋白酶酶解。接着用质谱鉴定蓄积在微流控芯片产品池中的酶解产物。对血红蛋白（HEM）和溶菌酶（LYS）的胰蛋白酶酶解证明了这个独特的蛋白酶解系统的可行性与性能。结果表明,红外线照射能够显著增强芯片上蛋白酶解,酶解时间显著缩短到了5 min。
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