甲型H1亚型流感病毒检测方法的建立及应用

论文摘要

2009年3月,在墨西哥暴发的“人感染猪流感”疫情,并迅速在全球范围内蔓延。经研究确定,此次疫情是由一个新型H1N1病毒亚型引起的,人群没有天然免疫力,疫情几经在全球范围传播。据世卫组织最新数据,全球有214个国家和地区报告了甲型流感确诊病例,出现至少18449个死亡病例。甲型H1N1流感对人及动物的健康造成巨大的影响,并且对社会造成了巨大的经济损失。鉴于甲型流感对畜牧业及人类公共卫生安全造成的巨大威胁,进行对甲型流感抗原实施监测以及时了解甲型流感的流行状况尤为重要,但目前市场上还没有检测甲型H1亚型猪流感病毒抗原(北美流感)的试剂盒,也无区分甲型H1亚型猪流感病毒(北美流感)和经典H1亚型流感病毒的鉴别诊断试剂盒,因此建立一系列简便快速、特异敏感、直观有效的用于甲型流感病毒的检测方法迫在眉睫。本课题研究过程中制备了多株抗甲型H1亚型流感病毒血凝素的单克隆抗体,并以此抗体作为原材料,分别建立甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法和甲型H1亚型流感病毒免疫胶体金检测方法,其分别具备灵敏度高、特异性强、操作简便以及可以批量测定等优点和简便快捷、特异性强的优点。为进一步诊断和监测甲型H1亚型流感抗原奠定了物质基础。1.甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的制备本研究通过接种、增殖甲型H1亚型流感病毒,将收获的尿囊液用甲醛灭活。用纯化后病毒免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。采用血凝抑制实验筛选,经过有限稀释法对其进行克隆,经过2次融合共获得10株能稳定分泌抗甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并得到特异性好、效价高的单克隆抗体。所得杂交瘤细胞株分别命名为1C9、2B3、2C5、2H7、3G12、4D7、4B12、4E1、5D5、5F7,腹水HI效价均在213～219,经试验测定,其中7株抗体只与甲型H1亚型流感病毒发生血凝抑制反应,而不与经典H1亚型猪流感病毒及其它亚型流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性,其余3株单克隆抗体不仅与甲型H1亚型流感病毒发生血凝抑制反应,而且与部分经典H1亚型猪流感病毒发生血凝抑制反应,对其它亚型流感病毒反应结果为阴性。2.甲型H1亚型流感病毒检测方法的建立以抗甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体基础,分别建立甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法和甲型H1亚型流感病毒免疫胶体金检测方法,其分别具备灵敏度高、特异性强、操作简便以及可以批量测定等优点和简便快捷、特异性强的优点。这两种方法对其它亚型的流感病毒进行检测,如：经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型的流感病毒,结果显示均为阴性；并且这两种方法对畜禽类主要病毒进行检测,如：将猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙脑病毒(JEV)、鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡减蛋综合症病毒(EDSV),结果显示均为阴性,说明这两种方法具有很好的特异性。以甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法为基础组装的甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒,弥补了目前市场上还没有检测甲型H1亚型猪流感病毒抗原(北美流感)的试剂盒,也无区分甲型H1亚型猪流感病毒(北美流感)和经典H1亚型流感病毒的鉴别诊断试剂盒的空白。以上两种检测甲型H1亚型流感病毒的方法,均能够准确、快速检测出畜群及人群中的甲型H1亚型流感病毒,对甲型H1亚型流感病毒的评估、预防及流行病学调查具有极其重要的意义。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（ABBREVIATION）
• 1. 文献综述
• 1.1 甲型H1N1流感研究进展
• 1.1.1 甲型H1N1流感的流行现状
• 1.1.2 甲型H1N1流感病毒的生物学特性
• 1.1.3 流感诊断方法
• 1.2 单克隆抗体研究
• 1.3 研究目的与意义
• 2. 抗甲型H1亚型流感病毒血凝素单抗克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 生物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要材料及仪器设备
• 2.1.4 主要试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗原制备
• 2.2.2 小鼠免疫
• 2.2.3 细胞融合
• 2.2.4 阳性杂交瘤细胞筛选
• 2.2.5 阳性杂交瘤细胞克隆化
• 2.2.6 单克隆抗体的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 融合后筛选及克隆化培养结果
• 2.3.2 染色体计数结果
• 2.3.3 单抗亚类鉴定结果
• 2.3.4 单抗HI效价
• 2.3.5 单抗特异性试验结果
• 2.3.6 TCID50的测定
• 2.3.7 间接免疫荧光结果
• 2.3.8 稳定性检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 抗原的制备及免疫
• 2.4.2 细胞融合和筛选
• 2.4.3 杂交瘤细胞的克隆及冻存复苏
• 2.4.4 杂交瘤细胞株建立过程污染控制
• 2.4.5 单克隆抗体特异性的鉴定
• 2.4.6 染色体计数
• 2.4.7 间接免疫荧光
• 3 甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及应用
• 3.1 材料
• 3.1.1 生物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要试剂的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 单克隆抗体腹水的纯化
• 3.2.2 抗体浓度及效价的测定
• 3.2.3 辣根过氧化物酶（HRP）标记单克隆抗体
• 3.2.4 甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA方法的建立
• 3.3 结果
• 3.3.1 单克隆抗体的提纯及检测
• 3.3.2 双抗体夹心ELISA检测方法包被抗体和酶标抗体配对的确定
• 3.3.3 方阵滴定的方法确定包被抗体及酶标抗体浓度
• 3.3.4 临界值的确定
• 3.3.5 封闭液的选择
• 3.3.6 特异性试验
• 3.3.7 敏感性实验
• 3.3.8 临床试验
• 3.3.9 甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒的组装
• 3.4 讨论
• 3.4.1 辣根过氧化物酶标记单克隆抗体
• 3.4.2 包被抗体和酶标抗体最佳配对的选择
• 3.4.3 封闭物的选择
• 3.4.4 临界值的确定
• 3.4.5 试剂盒特异性、敏感性试验
• 3.4.6 本试剂盒创新处
• 4 甲型H1型流感病毒免疫胶体金检测方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 生物材料
• 4.1.2 主要试剂及材料
• 4.1.3 主要试剂的配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 试验器皿的清洁
• 4.2.2 胶体金的制备
• 4.2.3 金标抗体的制备
• 4.2.4 结合垫、样品垫的预处理
• 4.2.5 金垫制备及抗体喷涂
• 4.2.6 免疫胶体金测试条的组装
• 4.2.7 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择
• 4.2.8 特异性试验
• 4.2.9 敏感性试验
• 4.2.10 对本实验室现有甲型H1型流感病毒检测
• 4.2.11 稳定性试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择
• 4.3.2 特异性试验
• 4.3.3 敏感性试验
• 4.3.4 对本实验室现有甲型H1型流感病毒检测
• 4.3.5 稳定性试验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 胶体金的制备
• 4.4.2 免疫胶体金标记
• 4.4.3 材料的选择
• 4.4.4 检测线和质控线划膜浓度的掌握
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录