禽流感病毒重组蛋白粘膜免疫研究及NP-ELISA抗体检测方法的建立

论文摘要

禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的禽类烈性传染病，世界各地都有AI的暴发和流行，给世界养禽业造成了巨大的经济损失。自1997年“香港禽流感”事件到目前为止，禽流感已造成了数百人感染及死亡，表明AI已经对人类健康构成了潜在的威胁，AI的研究具有重大公共卫生学意义。 目前AIV的诊断有病毒分离鉴定、血凝抑制、琼脂扩散和RT-PCR等方法，但上述方法由于耗时或操作复杂或需要昂贵仪器等缺点，难以在基层推广应用，因此AIV的快速诊断已成为目前迫切需要解决的问题之一。胶体金免疫层析快速检测AIV方法简便、快速、直观，而研制抗不同表位的单克隆抗体是该方法建立的必需前提。本研究研制了8份抗H9N2亚型AIV的单克隆抗体，效价高，特异性强，且分属于AIV的几个不同的抗原表位，是胶体金免疫层析法快速检测AIV的重要材料。 在研究敏感快速的诊断方法的同时，AI血清学抗体检测方法仍是重要的监测方法。本研究利用AIV核蛋白（Nucleoprotein，NP）具有型特异性的特点，建立了NP-ELISA抗体检测方法，可用于抗体的监测，为禽流感的流行病学调查提供了可靠的手段。 AIV血凝素（Hemagglutinin，HA）是诱导动物机体产生中和抗体的主要免疫原，也是决定病毒变异、毒力和宿主特异性的主要因素。利用HA基因或蛋白研制的疫苗可对同一亚型不同毒株的攻击产生近100％的保护作用。但是不同HA亚型抗体之间没有交叉反应和交叉保护性，这就给AI的检测和预防带来了困难，而M2抗原是在所有流感病毒中最为保守的蛋白之一，M2产生的抗体能够为机体提供针对不同亚型病毒攻击的保护力，而且能明显抑制病毒在呼吸道中的复制，因此M2蛋白是研究交叉保护性疫苗的理想候选抗原。本研究将HA蛋白和M2蛋白分别或融合表达，以期为发展具有高效和交叉免疫保护力的新型疫苗奠定基础。 AIV主要通过呼吸道和消化道侵入机体，因而粘膜免疫非常重要。霍乱毒素B亚单位（Cholera Toxin，CTB）可以有效诱发机体的粘膜免疫应答和分泌型IgA（Secretory IgA，sIgA）的产生。sIgA是粘膜免疫的主要效应因子，有抗蛋白酶水解作用，可长时间在消化道和呼吸道持续存在。特异性sIgA可在感染的最初阶段阻断禽流感病毒的侵入，因此，研究AIV主要抗原与粘膜免疫刺激物的互相作用，具有重要的理论意义和应用价值。 本项目以H9N2亚型AIV为研究对象，用现代分子生物学方法和技术，着重进行了AIV主要抗原基因的克隆和原核表达研究；重组AIV-HA、M2蛋白粘膜免疫机制研究；AIV主要抗原蛋白单克隆抗体研究；以AIV-NP表达蛋白为包被抗原，建立了NP-ELISA抗体检测方法。研究内容如下：

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 质粒、插图和附表清单
• 缩略词
• 第1章 文献综述
• 1.1 禽流感研究进展
• 1.1.1 禽流感的流行与危害
• 1.1.2 禽流感病毒
• 1.1.3 禽流感诊断方法研究进展
• 1.1.4 禽流感疫苗
• 1.1.5 禽流感的公共卫生意义
• 1.2 粘膜免疫研究进展
• 1.2.1 粘膜免疫效应简述
• 1.2.2 粘膜免疫佐剂
• 1.2.3 粘膜免疫展望
• 第2章 H9N2亚型禽流感病毒HA和M2蛋白的表达
• 2.1 研究的目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 全长HA基因和HA1基因的扩增
• 2.3.2 M2基因跨膜区的缺失突变
• 2.3.3 重组质粒pMT-HA和pMT-HA1的序列测定
• 2.3.4 重组质粒pMT-M2和pMT-sM2的序列测定
• 2.3.5 重组表达质粒pKG-HA1、pKG-sM2和pKG-HA1-sM2的构建
• 2.3.6 融合蛋白GST-HA1、GST-sM2、GST-HA1-sM2的表达和活性检测
• 2.3.7 融合蛋白特异性的ELISA检测
• 2.3.8 免疫小鼠抗体检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 M2基因的克隆与表达
• 2.4.2 HA1基因的克隆与表达
• 2.4.3 HA1和sM2基因的融合表达
• 2.5 小结
• 第3章 禽流感病毒M2蛋白和HA1蛋白粘膜免疫研究
• 3.1 研究的目的与意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 CTB基因的PCR扩增与重组质粒的酶切鉴定
• 3.3.2 重组质粒pKG-CTB-sM2的鉴定
• 3.3.3 重组质粒pKG-CTB-HA1的鉴定
• 3.3.4 融合蛋白GST-CTB、GST-CTB-sM2和GST-CTB-HA1的表达
• 3.3.5 免疫前后血清IgG抗体的ELISA检测
• 3.3.6 免疫前后血清IgA抗体的ELISA检测
• 3.3.7 免疫前后鼻腔洗液中sIgA抗体的ELISA检测
• 3.3.8 免疫前后气管洗液中sIgA抗体的ELISA检测
• 3.3.9 免疫前后肠洗液中sIgA抗体的ELISA检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于粘膜免疫与禽类粘膜免疫系统
• 3.4.2 禽流感与粘膜免疫防护
• 3.4.3 HA1和M2蛋白诱发的粘膜免疫应答
• 3.5 小结
• 第4章 N-P-ELISA抗体检测方法的建立
• 4.1 研究目的与意义
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 酶标抗体的制备及工作浓度测定
• 4.3.2 NP-EHSA最佳反应条件的确定
• 4.3.3 间接NP-ELISA判定标准的确定
• 4.3.4 血清样品单一稀释度ET直线方程的建立
• 4.3.5 比较试验
• 4.3.6 特异性试验
• 4.3.7 重复性试验
• 4.3.8 敏感性试验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 NP-ELISA的优点
• 4.4.2 NP-ELISA的灵敏性
• 4.4.3 结果判定的直观性
• 4.5 小结
• 第5章 禽流感病毒单克隆抗体的研制及其抗蛋白抗原分析
• 5.1 研究目的意义
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 病毒纯化
• 5.3.2 细胞融合
• 5.3.3 杂交瘤细胞的筛选
• 5.3.4 单克隆抗体的生产
• 5.3.5 效价测定及特异性鉴定
• 5.3.6 单克隆抗体亚类鉴定
• 5.3.7 染色体数的检测
• 5.3.8 纯化病毒和细胞感染病毒的抗原分析
• 5.3.9 单抗识别蛋白多肽分析
• 5.4 讨论
• 5.4.1 动物免疫
• 5.4.2 细胞融合
• 5.4.3 杂交瘤细胞的筛选
• 5.4.4 杂交瘤细胞的克隆
• 5.4.5 关于饲养细胞
• 5.4.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏
• 5.4.7 病毒裂解产生的多肽
• 5.4.8 单抗识别的蛋白抗原分析
• 5.5 小结
• 第6章 总结
• 参考文献
• 研究生期间发表的主要论文
• 致谢