论文摘要
蜂胶（propolis）是一种具有芳香味的粘性胶状固形物,它是蜜蜂用来密封蜂巢,起着杀死入侵病源微生物的作用。蜂胶含有多种活性成分,具有多种生理活性功能。研究表明,蜂胶具有一定的抗糖尿病的作用。目前国内外对蜂胶抗糖尿病作用研究报道主要集中动物模型试验,而对其抗糖尿病的机理研究未见其报道。为此,本论文重点研究了中国北方地区的蜂胶多酚类物质的提取、成分鉴定及其含量分析,测定蜂胶对α-糖苷酶的抑制作用及其机理以及抑制剂对α-糖苷酶的结构影响,并研究了蜂胶提取物对诱导糖尿病并发症的末端糖基化产物的抑制作用。1.以中国中北部部分地区的蜂胶为原料,采用超声波辅助75%乙醇进行提取,测定其总多酚和总黄酮的含量,并利用HPLC对各地区的提取物成分进行初步定性和定量分析,进而模拟蜂胶的区域性。不同地区的蜂胶含有的总多酚和总黄酮不同,河北地区的蜂胶总多酚含量最高为199.41mg没食子酸/g原胶,陕西地区的蜂胶总黄酮含量最高,为368.28mg芦丁/g原胶。从鉴定的成分上看,其中河南和黑龙江蜂胶分别还有最多的咖啡酸和P-香豆酸,为11.14mg/g原胶和13.46mg/g原胶；坎非醇、松属素、柯因、高良姜素、苯甲酰肉桂酯以河南蜂胶含量最高,分别为3.80、53.49、63.21、40.24、7.76mg/g原胶,芹菜素以辽宁蜂胶含量最多,为6.78mg/g原胶。区域性分析结果显示,河南和陕西的蜂胶具有很大的相似性,河北、山东和辽宁地区的蜂胶具有一定的相似性,安徽、湖北、黑龙江、吉林以及甘肃这些地区的蜂胶相似度较大,而北京地区的蜂胶与上述蜂胶相似度相对较小2.取北京地区蜂胶粉末,采用超声波辅助不同体积分数乙醇进行提取,离心取上清液,冷冻干燥,制备不同提取物。通过AB-8大孔树脂对提取物进行初步分离,得三个组分PEFS-1、PEFS-2和PEFS-3,分别测定不同提取分离物的总多酚和总黄酮含量,并利用HPLC对各组分成分进行分析。实验结果显示,蜂胶不同体积分数乙醇物中,以25%乙醇提取物的总多酚含量最多,为369.31mg没食子酸/g提取物,75%乙醇提取物含有最多的总黄酮,为697.36mg芦丁/g提取物；分离物中,PEFS-1含有总多酚最多,为513.62mg没食子酸/g提取物,PEFS-2含有最多的总黄酮,为832.17mg芦丁/g提取物；HPLC图谱显示,PEFS-1分离物以酚酸类物质居多,PEFS-2分离物以黄酮类物质居多以及PEFS-3以酯类和少量结构复杂的黄酮类物质为主。采用α-糖苷酶模型研究了蜂胶不同提取分离物的抗糖尿病作用。实验结果显示,蜂胶不同提取及分离物可以有效的抑制α-糖苷酶的活性；不同提取物中,75%乙醇提取物对酵母α-糖苷酶和小鼠肠道蔗糖酶抑制效果最好,水提取物对小鼠的肠道麦芽糖酶抑制效果最好；分离物中,PEFS-1对小鼠的肠道蔗糖酶和麦芽糖酶抑制效果最好,PEFS-2对酵母α-糖苷酶抑制效果最好。提取物、25%提-取物和PEFS-1抑制类型为竞争性抑制,75%提取物和PEFS-2抑制类型为非竞争性抑制,而50%、95%、100%提取物和PEFS-3对酵母α-糖苷酶的抑制类型却表现为线性混合竞争抑制。3.采用荧光光谱法、紫外-可见光光谱法及等温滴定微量热法分析了蜂胶不同提取分离物与酵母α-糖苷酶相互作用。结果显示,蜂胶不同提取分离物可以有效的猝灭酵母α-糖苷酶的内源性荧光；其中PEFS-2对α-糖苷酶内源性荧光猝灭效果最强；水提取物、25%提取物、95%提取物和PEFS-1为静态猝灭为主,动态猝灭为辅的猝灭机理,75%、100%提取物、PEFS-2及PEFS-3表现出动态猝灭为主,静态猝灭为辅的猝灭机理,而50%提取物却表现出不同浓度下猝灭的机理不同,低浓度为动态猝灭,高浓度却为静态猝灭。紫外光谱法和等温滴定微量热法都显示出蜂胶不同提取分离物可以有效的诱导酵母a-糖苷酶的结构改变。4.为了评价蜂胶不同提取分离物对糖尿病并发症的抑制作用,采用BSA-Glucose、BSA-MGO和BSA-GO模型研究蜂胶不同提取分离物对总末端糖基化产物、Pentosidine和CML的抑制作用及其作用的机理。实验结果表明,蜂胶提取分离物可以有效的抑制总末端糖基化产物和pentosidine的形成；其中75%乙醇提取和PEFS-2对总末端糖基化产物和pentosidine的抑制效果最好,而对CML的抑制效果都相对较差；通过荧光光谱和SDS-SPAG分析,水提取物和PEFS-1诱捕活性二羰基能力相对较强,而其他提取物和分离物相对较弱,说明酚酸类物质具有相对较强的二羰基捕获能力；蜂胶不同提取分离物是以抑制糖化蛋白的氧化为主,诱捕活性二羰基为辅,来抑制末端糖基化产物的形成。
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摘要ABSTRACT第一章 文献综述1.1 蜂胶简介1.2 蜂胶主要化学成分1.2.1 蜂胶中的黄酮类化合物1.2.2 蜂胶中的酚酸及其酯类化合物1.2.3 蜂胶中其它类物质1.3 ALPHA-葡萄糖苷酶抑制剂1.3.1 Alpha-葡萄糖苷酶的简介1.3.2 Alpha-葡萄糖苷酶抑制剂作用的机理1.3.3 Alpha-葡萄糖苷酶抑制剂的种类1.3.3.1 化学合成抑制剂1.3.3.2 天然产物抑制剂1.4 末端糖基化产物抑制剂1.4.1 末端糖基化产物简介1.4.2 末端糖基化产物的形成1.4.2.1 传统形成途径1.4.2.2 非传统形成途径—自动氧化糖基化1.4.3 末端糖基化产物病理学危害1.4.4 抑制末端糖基化产物的可能机理1.4.5 末端糖基化产物的抑制1.4.5.1 机体的自我修复1.4.5.2 化学药物抑制1.4.5.3 植物提取物抑制剂1.4.5.4 微生物类抑制剂1.4.5.5 发酵产物抑制剂1.4.5.6 食物中活性物质抑制剂1.4.6 末端糖基化产物的检测1.5 本论文的立题背景与研究内容1.5.1 立题背景和意义1.5.2 研究内容参考文献第二章 北方部分地区蜂胶提取物的成分分析2.1 材料与设备2.1.1 材料与试剂2.1.2 仪器与设备2.2 实验方法2.2.1 蜂胶提取物的制备2.2.2 标准对照品溶液配置2.2.3 样品中总多酚含量的测定2.2.4 样品中总黄酮含量的测定2.2.5 HPLC的分析条件2.2.6 线性关系考察2.2.7 精密度、稳定性和重复性实验2.2.8 样品中成份的初步定性2.2.9 HPLC-EIS-Q-TOF MS分析2.2.10 样品中各组分的定量2.2.11 加标回收率实验2.2.12 数据处理2.3 结果与分析2.3.1 总多酚和总黄酮标准曲线的绘制2.3.2 不同地区的蜂胶提取物中的总多酚和总黄酮含量2.3.3 液相条件的确定2.3.4 标准品混合2.3.5 精密度、稳定性和重复性实验2.3.6 线性关系2.3.7 中国北部地区的蜂胶液相图谱分析2.3.8 添加回收率考察2.3.9 不同地区蜂胶的HPLC聚类分析2.3.10 蜂胶提取物的HPLC-ESI-Q-TOF MS2.4 本章小结参考文献第三章 蜂胶提取分离物对ALPHA-糖苷酶的抑制作用3.1 材料与设备3.1.1 材料与试剂3.1.2 仪器与设备3.2 实验方法3.2.1 蜂胶提取物的制备3.2.2 HPLC的分析条件3.2.3 树脂的筛选3.2.4 上样浓度的确定3.2.5 上样速度的确定3.2.6 洗脱曲线确定3.2.7 吸附动力学实验3.2.8 树脂使用次数对分离效果的影响3.2.9 分离物的制备及其成分的分析3.2.10 总多酚含量的测定3.2.11 样品中总黄酮含量的测定3.2.12 α-葡萄糖苷酶活力的测定3.2.13 α-葡萄糖苷酶抑制率的测定3.2.14 小鼠肠道蔗糖酶的抑制作用3.2.15 小鼠肠道麦芽糖酶的抑制作用3.2.16 α-葡萄糖苷酶抑制动力学3.2.17 抑制常数的确定3.3 结果与分析3.3.1 树脂的筛选3.3.2 上样浓度的确定3.3.3 上样速度的确定3.3.4 洗脱曲线3.3.5 吸附动力学实验3.3.6 树脂使用次数对洗脱效果的影响3.3.7 不同乙醇水溶剂对组分的影响及其成分的分析3.3.8 总多酚和总黄酮含量3.3.9 蜂胶不同提取分离物对α-糖苷酶的抑制作用3.3.10 酶抑制动力学3.4 本章小结参考文献第四章 蜂胶提取分离物与ALPHA-糖苷酶的相互作用4.1 材料与设备4.1.1 材料与试剂4.1.2 仪器与设备4.2 实验方法4.2.1 α-糖苷酶的荧光实验4.2.2 α-糖苷酶紫外光光谱实验4.2.3 等温滴定微量热测定实验4.3 结果与分析4.3.1 α-糖苷酶溶液的激发波和发射波的确定4.3.2 不同提取分离物对酶的荧光猝灭光谱4.3.3 不同提取分离物对α-糖苷酶的荧光猝灭机理4.3.4 不同提取分离物与酶的紫外吸收光谱4.3.5 不同提取分离物与酶的三维荧光光谱4.3.6 等温滴定微量热仪测定分离物与α-糖苷酶的结合作用4.4 本章小结参考文献第五章 蜂胶提取分离物对末端糖基化产物的抑制作用5.1 材料与设备5.1.1 材料与试剂5.1.2 仪器与设备5.2 实验方法5.2.1 不同提取分离物清除糖类自动氧化产生的羟自由基能力5.2.2 不同提取分离物对BSA-Glucose模型中的末端糖基化产物的抑制5.2.3 蜂胶不同提取分离物对CML的抑制率5.2.4 蜂胶不同提取分离物对BSA-MGO模型中总末端糖基化产物的抑制5.2.5 蜂胶不同提取分离物对末端糖基化产物—Amadori的抑制5.2.6 蛋白羰基含量的测定5.2.7 蛋白硫醇含量的测定5.2.8 分析蛋白质结构变化5.2.9 利用SDS-PAGE分析蛋白结构5.3 结果与分析5.3.1 蜂胶不同提取分离物对葡萄自动氧化羟自由基的抑制作用5.3.2 不同提取分离物对总末端糖基化产物的抑制作用5.3.3 不同提取分离物对pentosidine和CML的抑制5.3.4 不同提取分离物对BSA-MGO中总末端糖基化产物的抑制作用5.3.5 不同提取分离物对Amadori产物的抑制作用5.3.6 不同提取分离物对蛋白质氧化修饰的抑制作用5.3.7 蛋白结构变化的分析5.3.7.1 蛋白质中色氨酸的荧光变化5.3.7.2 BSA-MGO模型中的牛血清白蛋白结构的三维荧光光谱分析5.3.10 SDS-SPAG对蛋白质结构的分析5.4 本章小结参考文献全文结论致谢硕士期间发表论文情况
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