补体C5b-9复合物对人RPE细胞膜通透性及VEGF、TGF-β2表达的影响

论文摘要

目的:补体系统激活,发生级联反应,是人体抵御外来侵害的第一线,但如果反应过度,则损伤正常组织而致病,其在老年性黄斑变性（age-related maculardegeneration,AMD）的脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）发病中的作用越来越受关注。补体C5b-9复合物,是补体级联反应的终末产物,在AMD患者CNV区域的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞表面可检测到其存在。本研究通过观察补体C5b-9复合物与人RPE细胞膜结合后细胞的形态学改变、胞浆内钙离子浓度变化及血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor,VEGF）、转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β2 mRNA水平变化,探讨补体C5b-9复合物对人RPE细胞膜通透性及细胞分子生物学行为的影响,探讨补体C5b-9复合物在CNV发病中的作用。方法:1.采用胰蛋白酶消化法培养人原代RPE细胞,并使用细胞角蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定。细胞传代至第2代—第3代用于后继实验。2.采用大鼠血清接触兔红细胞提取补体C5b-9复合物,蔗糖密度梯度超速离心法收集,并提纯、鉴定。3.取培养的人RPE细胞,加入不同浓度补体C5b-9复合物,分别为0、1、10、20、40、80μg/ml,处理24h,光学显微镜观察细胞形态学改变。并根据细胞膜有无溶破确定本研究后继实验采用的补体C5b-9复合物剂量。4.取正常RPE细胞和经补体C5b-9复合物作用后1h的RPE细胞,制作透射电子显微镜标本,观察细胞超微结构的改变。5.将正常培养的人RPE细胞按1×104/ml接种于特制的激光共聚焦显微镜专用培养皿。以钙荧光指示剂Fluo-3/AM负载。于激光共聚焦显微镜下,选定负载良好的RPE细胞视野,加入补体C5b-9复合物,观察细胞内钙荧光强度的变化。总的观察时间15min,间隔时间15s。随机选取视野内20个不同细胞,对所选区域进行荧光强度的定量分析,并记录该区域荧光强度的全程变化情况。6.取培养的人RPE细胞在补体C5b-9复合物作用4h、24h后,分别提取各时间组及正常培养的细胞总RNA,逆转录后行PCR检测VEGF、TGF-β2mRNA的相对表达量。结果采用SPSS13.0统计软件,方差分析法进行统计学分析,对各组均数之间比较。结果:1.体外培养的人原代RPE细胞,48h细胞贴壁,5—10d融合,传代稳定。细胞角蛋白抗体免疫组织化学染色阳性,符合上皮细胞特征。2.提取的补体C5b-9复合物经SDS—PAGE法鉴定,电泳呈现7条带,从上至下依次为C5b、C5c、C6、C7、C8αγ、C9和C8β,与文献相符。3.1、10、20μg/ml补体C5b-9复合物作用24h,细胞形态无明显改变。40μg/ml补体C5b-9复合物作用24h,细胞边界模糊,部分结构消失,培养液内可见大量黑色素颗粒。80μg/ml补体C5b-9复合物作用24h,仅见极少量完整RPE细胞,培养液充满黑色素颗粒。20μg/ml作为进一步实验选用剂量。4.透射电子显微镜下,正常培养的人RPE细胞胞膜完整,在细胞的一面可见到大量的绒毛组织,胞浆内存在大量的圆形或椭圆形色素颗粒,胞浆外未见杂质结构。20μg/ml补体C5b-9复合物作用RPE细胞后,透射电子显微镜显示色素颗粒从细胞内释出,细胞膜未见明显缺损,细胞周围可见色素颗粒团。5.培养的人RPE细胞以10μmol/l的钙荧光探针Fluo-3/AM,37℃孵育30min,可获得最佳负载效果。在激光共聚焦显微镜下,20μg/ml补体C5b-9复合物作用人RPE细胞后,多数细胞内的Ca2+荧光迅速增强,4min达到最大值,持续约6min后大部分细胞内升高的Ca2+荧光开始下降,随时间推移逐渐恢复至静息水平。6.20μg/ml补体C5b-9复合物作用人RPE细胞4、24h及正常对照组,VEGFmRNA的相对表达量分别为:1.53±0.49,1.32±0.39,1.00±0.15。与对照组比较,补体C5b-9复合物作用后4h,VEGF表达明显升高（p＜0.01）;之后有下调趋势,但24h与4h统计学无明显差异（p＞0.01）。TGF-β2 mRNA的相对表达量分别为:0.72±0.13,0.46±0.22,0.24±0.076。与对照组比较,补体C5b-9复合物作用后4hTGF-β2表达升高（p＜0.01）;24h下降（p＜0.01）,但仍高于对照组（p＜0.01）。结论:1.本研究采用胰蛋白酶消化法成功培养了人原代RPE细胞,细胞传代稳定,可满足实验研究需求。2.本研究通过实验室提取补体C5b-9复合物作用人RPE细胞,首次证实补体C5b-9复合物可改变RPE细胞膜的通透性,效果与补体C5b-9复合物的作用剂量相关。大剂量补体C5b-9复合物直接导致RPE细胞膜破碎,细胞坏死,降低作用剂量,则仅有色素颗粒通过RPE细胞膜释出。3.本研究首次证实补体C5b-9复合物可导致RPE细胞胞浆内Ca2+升高和VEGF、TGF-β2 mRNA上调,认为此分子生物学行为的改变是补体C5b-9复合物参与CNV形成的机制之一。4.本研究发现补体C5b-9复合物作用RPE细胞后,VEGF、TGF-β2 mRNA水平的变化与胞浆内钙离子变化趋势一致,认为VEGF、TGF-β2 mRNA上调与胞浆内Ca2+增高有关。综上所述,本研究提示补体C5b-9复合物参与CNV发病的机制可能为:眼后节补体系统通过经典或旁路途径激活,C5b-9复合物形成、沉积,使得RPE细胞膜通透性短暂改变,细胞内Ca2+增多,一系列信号传导途径启动,促血管形成的生长因子分泌增多,导致CNV形成。抑制眼内补体系统激活,可能是CNV防治的一条新途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、人RPE细胞的培养
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、补体C5b-9复合物对人RPE细胞的膜结合作用
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、补体C5b-9复合物对人RPE细胞内钙离子及VEGF、TGF-β2 mRNA表达的影响
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 老年性黄斑变性发病机制研究进展
• 综述参考文献
• 致谢